Цель:
1. Выделить аминокислоты из семян арабидопсиса.
2. Качественное определение аминокислот
Задачи:
1. Изучить метод селективной водно-этанольной экстракции.
2. Изучить метод качественного определения аминокислот нингидрином .
3. Изучить метод Чинарда.
Ход работы:
1.Взять 600 семян арабидопсиса и гомогенезировать их в 1 мл 80% этанола при температуре 45 градусов.
2.Перенести образец в 2 пробирки.
3.Промыть гомогенат 4 раза в 80% этанолом (по 300 мл) при температуре 45 градусов, каждый раз перенося экстракт в в 2 новые микропробирки.
4. Центрифугировать образцы 10 минут на скорости 5000 об/мин при температуре 4 градуса.
5. Перенести супернатант в две новые пробирки и поставить их на лед.
6. Образовавшийся в пробирках осадки ресуспендировать в 80% этаноле (100 мл на каждую пробирку) при температуре 75 градусов.
7. Встряхивать ресуспендированные образцы 5 мин в шейкере.
8. Центрифугировать ресуспендированные образцы 10 минут на скорости 5000об\мин при температуре 4 градуса.
9. Добавить супернатант к пробиркам с экстрактами, находящимися на льду.
Полученный супернатант можно использовать в качесттве источника свободных аминокислот. Оставшийся осадок содержит белки семян арабидопсиса.
Качественное определение аминокислот нингидрином .
Первичные аминокислоты легко реагируют с нингидридом с образованием интенсивно окрашенных продуктов. Аминокислоты способны реагировать с 2 молекуламя нингидрина за счет своей альфа-аминогруппы. В качестве продукта образуется пурпурный краситель Реуманна.
Ход работы.
1. Приготовит нингидриновый реагент путем растворения нингидрина в ацетоне до конц. 2%.
2. К 1 мл. р-ра аминокислоты (супернатанту0 добавить 3 капли нингидринового реагента.
3. Во 2-ой пробирке смешать 3 капли нингидринового реактива и 1 мл дистилированной воды (холостая проба).
4. Хорошо перемешать содержимое в обеих пробирках.
5. Выыдержать пробирки 5 мин.
6. После охлаждения реакционной смеси в обоих пробирках до комнатной температуры под струей воды сравнить образовавшуюся окраску.
Количественное определение диаминокислот нингидрином методом Чинарда.
В сильнокислой среде (pH=1) лизин и аргинин реагируют с нингидрином с образованием продуктов красно-коричневого цвета. В реакцию также могут вступать цитрулин, орнитин и пролин. Другие аминокислоты и амины с нингидрином в сильнокислой среде не реагируют.
Ход работы:
1. приготовить реактив Чинарда.
2. Проведение анализа
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод: нгидриновая реакция применяется для качественного и количественного анализа (обнаружения) в аминокислотных анализаторах для спектрофотометрического определения α-аминокислот. Нингидрин разлагает α-аминокислоты на альдегиды, оксид углерода (IV) и аммиак. Аммиак конденсируется с избытком нингидрина и с продуктами его восстановления. Продукты конденсации окрашены в розово-фиолетовый цвет. Различные α-аминокислоты образуют окрашенные соединения, отличающиеся оттенком.
Метод определения диаминокислот по Чинарду . Метод основан на образовании красно-коричневых продуктов взаимодействия диаминокислот с нингидрином с последующим фотоколориметрическим определением при длине волны 490 нм. Метод является специфичным: нейтральные аминокислоты, а также амины и диамины при pH 1 с нингидрином окрашенных продуктов не образуют. Несмотря на доступность и простоту данный метод не является универсальным для всех а-аминокислот и позволяет определить лишь диаминокислоты, из которых наибольшее практическое значение имеет незаменимая аминокислота лизин. Кроме того, этим методом можно определить пролин.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему