Нужна помощь в написании работы?

Цель:

1.      Выделить аминокислоты из семян арабидопсиса.

2.      Качественное определение аминокислот

Задачи:

1.      Изучить метод селективной  водно-этанольной экстракции.

2.      Изучить метод качественного определения аминокислот нингидрином .

3.      Изучить  метод Чинарда.

Ход работы:

Внимание!
Если вам нужна помощь в написании работы, то рекомендуем обратиться к профессионалам. Более 70 000 авторов готовы помочь вам прямо сейчас. Бесплатные корректировки и доработки. Узнайте стоимость своей работы.

1.Взять 600 семян  арабидопсиса и гомогенезировать их в 1 мл 80% этанола при температуре 45 градусов.

2.Перенести образец в 2 пробирки.

3.Промыть гомогенат 4 раза в 80% этанолом (по 300 мл) при температуре 45 градусов, каждый раз перенося экстракт в в 2 новые микропробирки.

4. Центрифугировать образцы 10 минут на скорости 5000 об/мин при температуре 4 градуса.

5. Перенести супернатант в две новые пробирки и поставить их на лед.

6. Образовавшийся в пробирках осадки ресуспендировать в 80% этаноле  (100 мл на каждую пробирку) при температуре 75 градусов.

7. Встряхивать ресуспендированные образцы  5 мин в шейкере.

8. Центрифугировать ресуспендированные образцы 10 минут на скорости 5000об\мин при температуре 4 градуса.

9. Добавить супернатант к пробиркам с экстрактами, находящимися на льду.

Полученный супернатант можно использовать в качесттве источника свободных аминокислот. Оставшийся осадок содержит белки семян арабидопсиса.

 

Качественное определение аминокислот нингидрином .

Первичные аминокислоты легко реагируют с нингидридом с образованием интенсивно окрашенных продуктов. Аминокислоты способны реагировать с 2 молекуламя нингидрина за счет своей альфа-аминогруппы. В качестве продукта образуется пурпурный краситель Реуманна.

Ход работы.

1. Приготовит нингидриновый реагент путем растворения нингидрина в  ацетоне до конц. 2%.

2. К 1 мл. р-ра  аминокислоты (супернатанту0 добавить 3 капли нингидринового реагента.

3. Во 2-ой пробирке смешать 3 капли нингидринового реактива и 1 мл дистилированной воды (холостая проба).

4. Хорошо перемешать содержимое в обеих пробирках.

5. Выыдержать пробирки 5 мин.

6. После охлаждения реакционной смеси в обоих пробирках до комнатной температуры под струей воды сравнить образовавшуюся окраску.

 

       
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Количественное определение  диаминокислот нингидрином методом Чинарда.

 

В сильнокислой среде (pH=1) лизин и аргинин реагируют с нингидрином с  образованием продуктов красно-коричневого цвета. В реакцию также могут вступать цитрулин, орнитин и пролин. Другие аминокислоты и амины с нингидрином в сильнокислой среде не реагируют.

Ход работы:

1. приготовить  реактив Чинарда.

2. Проведение анализа

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Вывод: нгидриновая реакция применяется для качественного и количественного анализа (обнаружения) в аминокислотных анализаторах для спектрофотометрического определения α-аминокислот. Нингидрин разлагает α-аминокислоты на альдегиды, оксид углерода (IV) и аммиак. Аммиак конденсируется с избытком нингидрина и с продуктами его восстановления. Продукты конденсации окрашены в розово-фиолетовый цвет. Различные α-аминокислоты образуют окрашенные соединения, отличающиеся оттенком.

 

Метод определения диаминокислот по Чинарду . Метод основан на образовании красно-коричневых продуктов взаимодействия диаминокислот с нингидрином с последующим фотоколориметрическим определением при длине волны 490 нм. Метод является специфичным: нейтральные аминокислоты, а также амины и диамины при pH 1 с нингидрином окрашенных продуктов не образуют. Несмотря на доступность и простоту данный метод не является универсальным для всех а-аминокислот и позволяет определить лишь диаминокислоты, из которых наибольшее практическое значение имеет незаменимая аминокислота лизин. Кроме того, этим методом можно определить пролин.
 

Поделись с друзьями