Поделись с друзьями

Явление репарации (восстановления) жизнеспособности клеток после действия на них рентгеновых лучей было открыто в 1949 г. в опытах на дрожжах, а затем и на бактериях.

Если бактериальные клетки облучить УФ-светом, то они в основном гибнут, так как УФ-лучи поглощаются ДНК с образованием в ней димеров тимина, что приводит к частичному или полному блокированию репликации. Тем не менее выявлены три основных механизма репарации ДНК после повреждений такого типа: фотореактивация, эксцизионная репарация и пострепликационная, или рекомбинационная репарация.

Фотореактивация – восстановление молекул ДНК, поврежденных УФ-лучами, в результате последующего воздействия на них видимого света. Бактериальные клетки содержат фермент фотореактивации – дезоксипиридинфотолиазу, синтез которого у бактерий E. coli детермини-

руется геном phr. Субстратом для этого фермента служат димеры тимина. Фермент находит в ДНК образовавшийся под действием УФ-лучей пиримидиновый димер и прочно связывается с ним. Если клетки перенести на видимый свет, то комплекс фермента фотореактивации и димеров тимина распадается, при этом происходит восстановление нормальной структуры ДНК.

Системы эксцизионной репарации удаляют неправильно спаренные или поврежденные основания из ДНК и затем синтезируют новую последовательность ДНК, замещающую их.

На первом этапе узнавания поврежденная структура распознается эндонуклеазой, которая разрезает

цепь ДНК на расстоянии восьми фосфодиэфирных связей с 5.-стороны и четырех-пяти связей с 3.-стороны от повреждения. На стадии вырезания 5.–3.-экзонуклеаза удаляет поврежденный участок. Образующийся одноцепочечный участок служит в качестве матрицы для ДНК-полимеразы I при синтезе цепи, замещающей вырезанную последовательность. Наконец, ДНК-лигаза ковалентно связывает 3.-конец нового материала со старым материалом.

Системы эксцизионной репарации включают у бактерий E. coli три гена: uvrA, uvrB, uvrC. Эти гены кодируют компоненты репарационной эндонуклеазы (uvrABC-эндонуклеазы).

Если повреждение в ДНК представляет собой структурное изменение (например, образование в результате УФ-облучения димера тимина), то поврежденные основания в процессе эксцизионной репарации удаляются, что ведет к восстановлению последовательности нуклеотидов, характерной для ДНК дикого типа. Однако если нарушение заключается в неправильном спаривании оснований, возникающем в результате мутирования одного из них, репарирующая система не может определить, какое именно основание представляет дикий тип, а какое – мутантный. Все это узнается как два неправильно спаренных основания, каждое из которых может служить объектом для эксцизионной репарации. Если вырезается мутантное основание, то восстанавливается дикий тип последовательно-

сти. Если же случается, что вырезается исходное основание (дикого типа), то новая (мутантная) последовательность закрепляется.

П. Говард-Фландерс (1968), этот механизм заключается не в исправлении повреждения в облученной ДНК, а в исправлении дефектной дочерней ДНК, образующейся после репликации поврежденной родительской ДНК. В результате репликации поврежденной нити ДНК образуется ДНК-копия с однонитевыми пробелами или брешами напротив димера тимина в родительской матричной цепи ДНК.

Бреши в дочерних нитях заполняются за счет пострепликационной репарации..

При репликации дефектной (поврежденной) ДНК фермент ДНК-полимераза останавливается перед димером тимина, а затем «перескакивает» через этот димер и продолжает репликацию, оставив за собой пробел (брешь) в дочерней цепи. Этот пробел заполняется в результате рекомбинации со второй дочерней молекулой ДНК, образующейся при репликации. Обмен цепями между молекулами ДНК осуществляет белок RecA. Возникающий пробел на второй молекуле заполняется ДНК-полимеразой, считывающей комплементарную нить с матричной неповрежденной нити. Лигаза окончательно восстанавливает непрерывность цепи.

Многие воздействия, которые повреждают ДНК или ингибируют ее репликацию у бактерий E. coli, индуцируют серию фенотипических изменений, получивших название SOS-ответа. Начало такого ответа определяется взаимодействием белка RecA с белком репрессором LexA. Ответ клетки на повреждающее воздействие начинается с активации протеазной активности белка RecA. Активирующим сигналом может быть присутствие одноцепочечной области в сайте повреждения. Активируясь, RecA-протеаза разрезает белок-репрессор LexA. Протеолитическое разрезание репрессора координированно индуцирует все эти опероны. Это пять генов din (от англ. damage inducible), гены recA, lexA, uvrA, uvrB, umuC и himA. Некоторые из sos-генов актив- ны только в поврежденных клетках; другие активны в необработанных, но уровень их экспрессии увеличивается при разрезании белка LexA. Установлено, что белок LexA репрессирует гены-мишени, связываясь с последовательностью ДНК длиной около 20 пар оснований, названной SOS-блоком.

Белки RecA и LexA являются взаимными мишенями в SOS-цикле. RecA разрезает LexA, который в свою очередь репрессирует RecA. SOS-ответ вызывает амплификацию обоих белков.