Современная вирусология располагает широким набором методов идентификации вирусов, к которым относятся вирусоскопические и вирусологические методы, методы серодиагностики, иммунодиагностики и молекулярно-генегические методы исследования.
Целью вирусоскопического исследования является обнаружение крупных вирионов и внутриклеточных включений с помощью светового Вирионы могут быть выявлены также с помощью электронной микроскопии.
Цель вирусологического исследования - выделение вирусов и их идентификация до уровня вида. О наличии вируса в культуре клеток судят на основании следующих показателей:
• цитопатического действия, которое выражается в изменении морфологии клеток: уменьшении их размеров и формы, пикнозе ядер, образов гигантских многоядерных клеток (симпластое ной деструкции монослоя клеток, наличии внутриклеточных включений
• обнаружения специфических вирусных антигенов методом иммунофлуоресцеяции. Препараты из исследуемого материала обрабатывают специфической иммунной сывороткой, а затем флуоресцирующей антиглобулиновой сывороткой, содержащей изотиоцианат флуоресцеина (зеленое свечение) или сульфохлорид родамина, дающий красное свечение (непрямой метод), либо меченой специфической сывороткой (прямой метод). При люминесцентном микроскопировании препаратов при одних вирусных инфекциях специфический антиген выявляется в цитоплазме в виде ярко светящихся конгломератов различной величины и формы, при других инфекциях антиген обнаруживается в ядре. На поздней стадии инфекции клеток обнаруживается свечение всей массы цитоплазмы и ядра;
• метода цветной пробы, при котором клетки культуры ткани размножаются в среде с индикатором рН. В случае нормального развития клеток происходит закисление среды продуктами метаболизма и изменение ее цвета. Репродукция вируса в культивируемых клетках нарушает их нормальный метаболизм, и цвет среды не изменяется;
• феномена гемадсорбции и гемагглютинации. На поверхности клеток, зараженных вирусом, содержащим в составе суперкапсида гемагглютинии, экспрессируются значительные его количества, и клетки приобретают способность адсорбировать или агглютинировать добавленные к ним эритроциты. В первом случае реакция учитывается микроскопически, во втором случае - визуально;
• образования бляшек под агаром. В монослое культивируемых клеток, покрытом тонким слоем агара с добавлением индикатора (например, нейтрального красного), в местах расположения погибших клеток формируются негативные или отличные по цвету колонии (бляшки);
• реакции интерференции, применяемой при отсутствии возможности использования перечисленных методов. Для этого культура клеток с исследуемым материалом дополнительно заражается лабораторным штаммом вируса, вызывающим цитопатическое действие. Считается, что морфологические изменения клеток наблюдаются только в случае отсутствия вирусов в исследуемом образце.
Идентификацию вирусов осуществляют методами серодиагностики, выявляя антитела и нарастание их титра в сыворотке крови с использованием различных иммунологических реакций, и методами иммунодиагностики, обнаруживая антигены с помощью диагностических противовирусных сывороток. Идентификация вирусов с помощью серологических методов включает использование:
а) реакции торможения гемагглютинации (РТГА);
б) реакции задержки гемадсорбции и реакции нейтрализации (РН) с учетом результатов по гемадсорбции;
в) реакции связывания комплемента (РСК);
г) иммуноферментного анализа (ИФА);
д) реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА или РИГА).
РТГА используется для идентификации неизвестного вируса по известной специфической сыворотке или для определения специфических антител в сыворотках переболевших животных и человека по известным антигенам. Использование РСК позволяет обнаружить специфические компле-аощие антитела в исследуемых сыворотках и определить тип вируса.
Сущность метода ИФА состоит в том, что антитела диагностических сывороток метят ферментами (пероксидаза хрена, щелочная фосфатам и др.) и учет результатов реакции проводят под обычным световым микроскопом.
В РНГА один из компонентов (антиген или антитело) адсорбирован на эритроцитах, которые при образовании комплекса антиген - антитело склеиваются и выпадают в осадок. позволяет выявлять и идентифицировать неизвестный вирусный антиген, а также антитела и определять их титр в исследуемых сыворотках.
Молекулярно-генетические методы идентификации осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции, гибридизации с соответствующими ДНК- или РНК-зондами.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему