Ввести рекомбинантный ген в клетку можно 2 способами: используя вектора или путем прямого введения.
Прямое введение гена в клетку осуществляют несколькими способами (Методы трансформации животных и растительных клеток):
1. Трансфекция. ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция (Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.
2. Микроинъекция стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора. Преимущество метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.
3. Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран.
4. Метод «мини-клеток». «Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток митозе колцемидом. При продолжительной обработке клеток колцемидом в них вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Обработка цитохалазином В и центрифугирование приводит к образованию мини-клеток, представляющих микроядра, инкапсулированные в ЦПМ.
5. Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.
6. Электронная пушка: на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора. Вольфрамовые частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10—15 см. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.
Векторы для трансформации содержат специфические последовательности, способствующие интеграции в геном. Современные векторные системы часто бывают полифункц, совмещая несколько функций в одном векторе. Б-во из них сконструировано при помощи методов генной инженерии. В качестве векторов прокариот используют плазмиды, фаги и их комбинации. На основе Ti-плазмиды сконструированы промежуточный и бинарный векторы. Перспективным вектором считаются Ri-плазмиды (англ. «root inducinq» - индуцирующий корни) из бактерий (A. rhizodenes), вызыв усилен обр-е корешков при заражении бактерий. . В качестве векторов растений используются ДНК-содержащие вирусы (их только 1-2% от вирусов, инфицирующих растения). Это содержащий 1цеп ДНК вирус золотой мозаики фасоли (ВЗМФ) или вирус полосатой кукурузы, а также вирус с 2хцеп ДНК - вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения семейства крестоцветных.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему