Принципы конструирования рекомбинантных молекул ДНК. Клонирование генов. Понятие о векторах. Требования, предъявляемые к векторам. Векторы клонирования.

в конце 70-х годов - векторная  трансформация, в основе подхода — использование векторных молекул, или векторов, в качестве кот применяли плазмиды. Векторы — это молекулы ДНК, способные переносить включенные в них гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом. Методы получения индивидуальных генов, наработка их препаративных количеств путем клонирования - техника генной инженерии, включающая: выделение индивидуальных фрагментов ДНК любого происхождения, их стабильное воспроизведение в составе векторов, идентификация функций клонированных генов, их изменение и введение в клетки исходного или иного организма. Эта техника получила также название техники рекомбинантной ДНК.

Получение генов.1ый успешный эксперимент по выделению группы генов лактозного оперона Е. соli (1969). Глав роль на 1 этапе выделения гена отводят эндонуклеазам рестрикции,(рестриктазам). Эти ферм разрезают ДНК вблизи или внутри определенных последоват нуклеотидов, которые одинак на обеих комплементарных цепях. 2 разрыва на концах фрагмента образуют липкие концы, кот могут вновь замыкаться благодаря комплементарности оснований. Последовательности, узнаваемые рестриктазами, статистически разбросаны по геному. Чем короче последовательность, тем чаще она встречается, тем короче фрагменты ДНК, образующиеся при рестрикции. Фрагменты рестрикции, (рестрикты), можно разделить по их молекулярной массе и заряду при помощи электрофореза в геле. Сущ способ хим синтеза генов (для инсулина). Те же подходы применяют для синтеза ДНК-зондов, т.е. небольших участков генов (20'—30 п.н.), если известна хотя бы часть 1ой структуры нужного белка. Такие зонды используют для поисков нужной комплементарной им иРНК. выделенную при помощи зонда иРНК используют для синтеза кДНК (комплементарной ДНК) с помощью фермента обратной транскриптазы.

Клонирование генов. Векторы. Для выделения нужного фрагмента ДНК в препаративных количествах его необходимо встроить в плазмиду - вектор, вскрытую той же рестриктазой, которую использовали для получения рестриктов геномной ДНК. В качестве векторов служат плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам. Например, плазмида рВR322 несет гены устойчивости к ампициллину(Ap) и тетрациклину(Tc). В гене Ар находится уникальный сайт для рестриктазы Pst1, а в гене Tc - для ВаmH1. Вскрывая вектор рВR322 по сайту ВаmН1 в гене Тc, в него можно встроить фрагменты, полученные при помощи той же рестриктазы за счет взаимодействия липких концов. Ковалентное соединение вектора и клонируемого фрагмента завершает полинуклеотидлигаза. Если теперь трансформировать клетки компетентной культуры Е. соli плазмидой рВR322 со встроенным в нее фрагментом, то трансформантов можно отобрать на среде с ампициллином. Далее проверить по признаку устойчивости к тетрациклину. Если интактная плазмида, то трансформант будет устойч к тетрациклину так же как и к ампициллину. Если же трансформацию осуществила плазмида со вставкой фрагмента в ген Тс', трансформант должен быть чувствителен к тетрациклину, поскольку ген Тс' оказался разорван и инактивирован вставкой. Векторы типа плазмиды рВR322 называют векторами инактивации. Широко применяют также векторы на основе бактериофага λ, т.к. средняя часть генома не существенна для его литического размножения в Е. соli и мб заменена на чужеродный фрагмент ДНК. Сущ множество типов векторов, сконструированных на основе различных плазмид и разл бактериофагов.

Не всегда удается получить фрагменты ДНК с липкими концами.Эти концы мб «пришиты» к фрагментам ДНК искусственно. Одну цепь таких молекул с тупыми концами наращивают за счет олигодезокси-А, а другую — за счет олигодезокси-Т при помощи нуклеотидилтрансферазы. Тупые концы наращивают также за счет синтетических линкеров - последовательностей, «узнаваемых» определенной рестриктазой или несколькими из них. После обработки соответствующей рестриктазой концы становятся липкими и фрагмент можно встроить в вектор, вскрытый той же рестриктазой.

Основные этапы манипуляции с генами. 1. Выделение гена, 2. Клонирование. 3. Трангеноз. 4. Экспрессия генов(регулыция). Ферменты: рестриктазы, полимеразы, обратные транскриптазы, лигазы. Выделение гена. Источники: хим.синтезированные, комплиментарные Днк, геномная ДНК-хромосомы. Разрезание ДНК рестриктазами: распознают палиндромы, появление комплементраных липких(тупых)концов. Виды векторов: Плазмидные, на основе фага лямбда, космиды(плазмида+фаг лямбда), сверхъёмкие векторы.

Библиотека (банк) генов — это набор фрагментов ДНК, в котором представлены все (или определенная часть) генов организма. Библиотека генов представляет собой совокупность культур микроорганизмов (бактерий, дрожжей), в каждую клетку которых введен вектор, несущий один из фрагментов генома организма. Библиотеку генов можно длительно хранить (в замороженном состоянии) и, по необходимости, выделять отдельные микроорганизмы, содержащие фрагменты ДНК с нужными генами, и размножать (клонировать) их. Клонированные таким способом гены выделяют из клеток и используют для решения различных теоретических и практических задач генетики, медицины (в том числе диагностики наследственных болезней) и биотехнологии.

N=ln(1-p)/ln(1-f)- необходимое число генов. Р- вероятность перекрывания данного генома. Ф- частота генотипа в каждом клоне(размер вставки). Библиотека чел на векторе фага лямбда: чел 3 млрд п.н./лямбда 17000пн.=800000 фагов.

Эукариотический вектор представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться в клетках животных. Помимо последовательностей нуклеотидов, обеспечивающих репликацию, эукариотические векторы могут содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках животных и растений, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно, эукариотические векторы должны быть челночными векторами . Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых ферментативными системами эукариотических клеток. В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид встречаются редко. Поэтому при конструировании векторов, способных реплицироваться и осуществлять экспрессию в клетках животных, чаще всего используют регуляторные генетические элементы вирусов животных или эукариотических генов домашнего хозяйства и генов, для которых характерна тканеспецифическая экспрессия.

Дрожжи как объекты генетической инженерии: Многие данные по цитологии, биохимии и генетике эукариот были впервые получены на дрожжах рода Saccharomyces. Особенно это положение касается биогенеза митохондрий: дрожжи оказались одними из немногих организмов, способных существовать только за счёт гликолиза и не гибнущих в результате мутаций в геноме митохондрий, препятствующем их нормальному развитию. Для генетических исследований важен короткий жизненный цикл дрожжей и возможность быстрого получения большого числа их особей и поколений, что позволяет изучать даже очень редкие явления.