Репликация ДНК

Для того чтобы объяснить, каким образом может самокопироваться, или редуплицироваться, такая стабильная и замкнутая на себя структура, как двойная спираль ДНК, Уотсон и Крик предположили, что ее цепи способны к раскручиванию и последующему частичному разделению вследствие разрыва водородных связей в каждой комплементарной паре оснований. Образовавшиеся одноцепочечные участки родительской молекулы могут служить матрицей, к которой на основе комплементарности оснований присоединяются соответствующие нуклеотиды. Эти нуклеотиды скрепляются между собой фосфодиэфирными связями с образованием новой цепи, комплементарной родительской. Так как этот процесс происходит на каждой разделившейся цепи исходной молекулы, то в результате образуются две двухцепочечные структуры, идентичные родительской ДНК. Такой способ репликации получил название полуконсервативного, поскольку в каждой из вновь образовавшихся молекул одна цепь является старой (родительской), а другая — вновь синтезированной (дочерней). Этот механизм обеспечивает возможность такого распределения ДНК между делящимися клетками, при котором каждая дочерняя клетка получает гибридную двухцепочечную молекулу ДНК, состоящую из родительской и вновь синтезированной цепей.              Первые данные в пользу гипотезы полуконсервативного механизма синтеза ДНК были получены Дж.Тэйлором с соавторами (1957) цитологическим методом при изучении репликации хромосом конских бобов (Vicia faba). Экспериментально эта гипотеза была доказана с помощью физико-химических методов М.Мезельсоном и Ф.Сталем (1958). Сущность их опыта состояла в следующем. Бактерии (Е. coli) на протяжении многих генераций выращивали в среде, содержащей в качестве источника азота только его тяжелый изотоп 15N. Эта метка включалась в азотсодержащие пуриновые и пиримидиновые основания в ДНК, вследствие чего ДНК в клетках, выращенных в среде с |5N, имела большую молекулярную массу на единицу объема (т.е. большую плотность), чем ДНК в клетках, выращенных в обычных условиях, в присутствии легкого изотопа 14N. Поэтому если клетки после длительного выращивания на среде с 15N отмывали и переносили на время,  равное одной, двум и т.д. генерациям, в среду с 14N вместо 15N, то это должно было привести к появлению молекул ДНК с меньшей плотностью.

         По прошествии одной генерации после переноса из среды с 15N в среду с 14N в клетках появилась гибридная по плотности ДНК, у которой одна цепь была «тяжелой», а другая — «легкой». Если ДНК выделяли из клетки через две генерации после такого переноса, то «гибридная» ДНК составляла лишь половину всей ДНК. В следующем поколении эта «легкая» фракция увеличивалась и составляла 75 % тотальной ДНК. Такое изменение можно объяснить только с позиций представления о полуконсервативном способе

репликации ДНК.

         Сделанный  Мезельсоном  и  Сталем  вывод был  полностью подтвержден и для других объектов, включая животных и высшие растения. Вместе с тем оставалось неясным, в каком направлении происходит репликация ДНК и какие ферменты обеспечивают этот процесс. Ответ на первый вопрос удалось получить Дж.Кэрнсу (1963) в опытах на Е. сoli. Результаты опытов показали, что раскручивание двух комплементарных цепей родительской ДНК и их полуконсервативная репликация происходят практически одновременно и начинаются в общей точке начала репликации, обозначаемой как локус ori (от англ. origin — начало). Последующий анализ результатов опыта Кэрнса и данные других экспериментов, нацеленных на изучение механизма репликации ДНК у различных бактерий, фагов, плазмид, показали, что в большинстве случаев она происходит двунаправленно и начинается, как правило, от одного уникального локуса ori. В этом месте в одной из цепей ДНК разрывается фосфодиэфирная связь, обеспечивающая последующее раскручивание дуплекса и образование особых структур — репликативных вилок, движущихся в противоположных направлениях по кольцевой ДНК. Следует, однако, отметить, что в ДНК эукариот, как правило, обнаруживается не один, а множество локусов ori, что, по-видимому, служит необходимым условием для того, чтобы громадные молекулы ДНК в хромосомах эукариот успели полностью отреплицироваться за время одного клеточного цикла.

         Эксперименты, проведенные на прокариотах (Е. соli, фаг Т7, некоторые плазмиды), также выявили в их ДНК (скорость репликации которых составляет около 20 мкм/мин, что в 20—30 раз выше, чем у эукариот) не по одному, а по два или даже более локусов ori.