Титр бактериофага, методы его определения. Выявление вирусов животных и растений.

Титр бактериофага - это количество активных фаговых частиц в единице объема исследуемого материала. Для определения титра бактериофага наиболее широко в работе с бактериофагами применяется метод агаровых слоев, предложенный А. Грациа в 1936 г. Этот метод отличается простотой выполнения и точностью получаемых результатов и с успехом используется также для выделения бактериофагов.

Сущность метода состоит в том, что суспензию бактериофага смешивают с культурой чувствительных бактерий, вносят в агар низкой концентрации («мягкий агар») и наслаивают на поверхность ранее подготовленного 1,5%-го питательного агара в чашке Петри. В качестве верхнего слоя в классическом методе Грациа использовался водный («голодный») 0,6%-й агар. В настоящее время для этих целей чаще всего применяют 0,7%-й питательный агар. При инкубации в течение 6-18 ч бактерии размножаются внутри верхнего «мягкого» слоя агара в виде множества колоний, получая питание из нижнего слоя 1,5%-го питательного агара, который применяется в качестве подложки. Низкая концентрация агара в верхнем слое создает пониженную вязкость, что способствует хорошей диффузии фаговых частиц и инфицированию ими бактериальных клеток. Инфицированные бактерии подвергаются лизису, в результате чего появляется потомство фага, которое вновь заражает находящиеся в непосредственной близости с ними бактерии. Образование негативной колонии для фагов Т-группы вызвано только одной частицей бактериофага, и, следовательно, число негативных колоний служит количественным показателем содержания бляшкообразующих единиц в исследуемом образце.

Культура чувствительных к фагу бактерий используется в логарифмической фазе роста в минимальном количестве, обеспечивающем получение сплошного газона бактерий. Соотношение числа фаговых частиц и бактериальных клеток (множественность инфекции) для каждой системы «фаг - бактерия» подбирается экспериментально с таким расчетом, чтобы на одной чашке образовывалось 50-100 негативных колоний.

Для титрования бактериофага может быть использован также однослойный метод, состоящий в том, что на поверхность чашки с питательным агаром вносят суспензии бактерий и бактериофага, после чего смесь распределяют стеклянным шпателем. Однако этот метод уступает в точности методу агаровых слоев и поэтому не нашел широкого применения.

Техника титрования и культивирования бактериофагов. Для определения титра бактериофага последовательно разводят исходную фаговую суспензию в буферном растворе либо в бульоне (шаг разведения 10-1). Для каждого разведения используют отдельную пипетку, а смесь интенсивно перемешивают. Из каждого разведения суспензии делают «высев» фага на газон чувствительных бактерий Е. coli В. Для этого 1 мл разведенного фага вносят в пробирку с 3 мл расплавленного и охлажденного до 48-50°С «мягкого агара», после чего в каждую пробирку добавляют 0,1 мл культуры чувствительного микроорганизма (Е. coli В), находящегося в логарифмической фазе роста. Содержимое перемешивают, вращая пробирку между ладонями и избегая образования пузырей. Затем быстро выливают на поверхность агаризованной (1,5%-й) питательной среды в чашке Петри и равномерно распределяют по ней, осторожно покачивая чашку. При титровании методом агаровых слоев следует засевать параллельно не менее двух чашек одного и того же разведения фага. После застывания верхнего слоя чашки переворачивают крышками вниз и помещают в термостат с температурой 37°С, оптимальной для развития чувствительных бактерий. Учет результатов производят через 18-20 ч инкубирования.

Количество негативных колоний подсчитывают аналогично подсчету колоний бактерий, а титр фага определяют по формуле:

где N - количество фаговых частиц в 1 мл исследуемого материала; n -среднее количество негативных колоний на чашку; D - номер разведения; V — объем высеваемой пробы, мл.

В том случае, когда необходимо определить множественность инфекции, параллельно проводят определение титра жизнеспособных клеток бактерий Е. coli В в 1 мл питательного бульона. Для этого делают разведение исходной суспензии бактериальных клеток до 10-6 и высевают ее (0,1 мл) параллельно на 2 чашки. После инкубирования при температуре 37 °С в течение 24 ч подсчитывают количество образовавшихся колоний на чашке Петри и определяют титр клеток.