Методы получения фаголизатов.

Фаголизат - суспензия бактериофага, полученная после лизиса зараженных фагом клеток бактерий. Для этого можно использовать как жидкие, так и агаризованные питательные среды.

Фаголизат получают путем размножения фага на клетках чувствительной культуры. В бульонную культуру бактерий E.coli В вносят 1-2 мл фаговой суспензии либо касаются бактериальной петлей изолированной негативной колонии и эмульгируют ее в питательном бульоне. После соответствующего периода инкубирования и просветления суспензии фаголизат освобождают от бактериальных клеток одним из следующих способов:

• фильтрованием через мембранный фильтр;
• центрифугированием для осаждения клеток (6 тыс. об/мин, 10 мин);
• обработкой фаголизата хлороформом в соотношении 10:1 с последующим энергичным встряхиванием в течение одной минуты, инкубированием в течение одного часа при комнатной температуре и центрифугированием.

Техника получения фаголизата бактериофагов Т-группы в жидкой питательной среде. 18-24-часовую культуру чувствительных к фагу бактерий (Е. coli В) засевают в жидкую питательную среду в соотношении 1:10 и культивируют с аэрированием при оптимальных условиях (37 °С) до логарифмической фазы роста в течение 2,5-3 ч (до плотности 2-108 клеток/мл). После этого в бактериальную культуру добавляют суспензию фага с таким расчетом, чтобы множественность инфекции составляла единицу, и продолжают инкубирование в течение 6-8 ч с аэрацией до просветления бактериальной культуры.

Фаголизат освобождают от бактерий низкоскоростным центрифугированием (6 тыс. об/мин, 10 мин) или фильтрованием через бактериальные фильтры и определяют титр полученного фага.

В жидкой среде можно получать большие объемы фаголизатов с соержанием фаговых частиц около 5-109 в 1 мл.

Техника получения фаголизата бактериофагов Т-группы с использоанием агаризованной питательной среды. Этот метод, предложенный М. Сванстромом (М. Swanstrom) и М. Адамсом (М. Adams) в 1951 г., залючается в лизисе фагом густой суспензии чувствительных бактерий в слое полужидкого агара, В 3 мл 0,7%-й агаризованной питательной среды вносят 0,1 мл культуры чувствительных бактерий Е. coli В в логарифмической фазе роста и 1 мл суспензии одного из фагов Т-группы (конечная концентрация 104-105 частиц/мл), перемешивают и выливают на поверхность 1,5%-й агаризованной питательной среды в чашках Петри. Таким образом проводят засев нескольких чашек. Чашки инкубируют в течение 18-20 ч, а затем в каждую из них вносят 5 мл физиологического раствора или жидкой питательной среды и шпателем осторожно снимают верхний (0,7%-й) слой агара. Для удаления бактерий и остатков агара полученную массу центрифугируют (6 тыс. об/мин, 10 мин). После серии разведений полученного фаголизата определяют титр фага.

Экспериментально выявлено, что на плотной питательной среде количество полученного фаголизата оказывается меньше, чем в случае приготовления его в жидкой питательной среде, но титр бактериофага в этом случае несколько выше - 109—1011 частиц/мл.