Бакуловирусы насекомых. Особенности их репликации и использование в качестве векторов экспрессии в биотехнологии.

Вирионы бакуловирусов представляют собой палочковидные нуклеокаспиды. Заключённые в липопротеиновую оболочку. Геном представлен двуцепочечной ДНК, размером до 160 тпн. Группа бакуловирусов подразделяется на субгруппы, 2 из которых формируют большие белковые кристаллы, куда упаковываются их вирионы. Данные кристаллы носят название – тела включения.

Субгруппа А – вирусы ядерного полиэдроза (NPV): образуют в ядре клетки полиэдры.

Субгруппа B – вирусы гранулёза(GV): в цитоплазме образуются кристаллические включенияв виде овальных гранул. В каждой грануле как правило 1 вирион.

Субгруппа С – не образуют тел включений.

Заражение происходит путём поедания белковых кристаллов насекомыми. Кристаллы растворяются в щелочной среде средней кишки, что провоцирует заражение. Первоначальные вирионы инфицируют клетки эпителия кишечника, где формируются свободные вирионы, которые затем попав в гемолимфу, разносятся по тканям организма, где и формируют впоследствии тела включения.

Интерес вызывают механизмы, которые контролируют синтез большого количества полиэдрина или гранулина. ( 25% суммарного белка клетки) Такой синтез указывает на высокое содержание мРНК белков вируса в клетке. А такое количество мРНК говорит о силе промотора.

Регуляция экспрессии осуществоляется по каскадному типу: предранние альфа-гены  активируются факторами клетки-хозяина. Продукты альфа-генов активируют запаздывающие бета-гены и некоторые поздние гамма-гены. Экспрессия поздних генов связана с ситнезом вирусной ДНК. Очень поздние сигма-гены обуславливают образование тел включения и экспрессируются тогда, когда репрессирована активность альфа-, бета- и гамма-генов.

Целевой ген встраивают внутрь фрагмента вирусной ДНК, клонированного в составе векторной плазмиды. В результате получают конструкцию, в которой целевой ген фланкирован последовательностями ДНК из определённого района вирусного генома. Котранфекцией в чувствительные клетки вводят нативную вирусную ДНК и гибридную плазмиду. В процессе рекомбинации по участкам гомологии происходит встройка целевого гена в выбранный участок вирусного генома.

Фенотипическим маркером для определения рекомбинантых вирусов является продукция полиэдрина. Путём вставки целевого гена в ген полиэдрина при участии ферметов S1, экзонуклеазы E. Coli III, ДНК-полимеразы Т4 и ДНК-лигазы.