Понятие «дифференциация» отражает превращение эмбриональной, меристематической клетки в специализированную. Любая живая растительная ткань, помещенная на подходящую ПС, переходит к делению и образует массу недифференцированных клеток - каллус. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (пролиферацией) дедифференцированных клеток.
каллус – неорганизованная меристематическая или опухолеподобная масса растительных клеток, формирующихся in vitro Доддсу и Робертсу (Dodds, Roberts, 1985.
Терци и Санг определяют (Terzi, Sung, 1986) каллус как произвольно пролиферирующую ткань, растущую на твердой поверхности.
В работе Муромцева с соавт. (1990) каллусом названа ткань, возникающая путем неорганизованной пролиферации клеток растений.
Батыгина (1987), каллус – гетерогенная интегрированная структура, образующаяся в результате пролиферации клеток на поверхности отдельных структур растительного организма; каллус формируется, как правило, из исходно разных генеративных или вегетативных органов; состоит из групп неоднородных клеток, имеющих морфогенетические потенции, которые реализуются различными путями (эмбриоидогенез, органогенез, гистогенез).
Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее в каллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов.
Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению (2,4-Д, НУК, ИУК, ИМК).
Цитокинины — пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток (зеатиен, БАП, 2iр, кинетин).
Морфологические и физиологические характеристики каллусных культур:
• Каллусные культуры выращиваются поверхностным способом на полутвердой агаризованной среде, среде с применением желирующих полимеров, либо на мостиках из фильтровальной бумаги, погруженных в жидкую питательную среду.
• Основными компонентами питательных сред для культуры клеток и тканей растений являются минеральные соединения (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста.
• Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, кокосовое молоко, экстракты из определенных органов растений).
• Каллусная ткань чаще всего представляет собой аморфную массу паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным (пигментированным антоцианами). Как правило, в длительно пересадочной культуре на средах, включающих ауксин, особенно синтетический аналог ауксина – 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.
• Каллусные клетки в пересадочной культуре спонтанно могут приобрести гормоннезависимость. Природа такой гормоннечувствительности к одному или обоим гормонам (ауксину и цитокинину), применяемым при выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормоннезависимость клетки).
Основные характеристики каллусных культур:
• основной важнейшей особенностью популяции соматических клеток является нестабильность генома клеток и их генетическая гетерогенность – появление в процессе культивирования полиплоидных, анеуплоидных клеток, клеток с хромосомными абберациями и генными мутациями.
• Причины генетической гетерогенности:
• 1. Генетическая гетерогенность исходного материала.
• 2. Нарушение коррелятивных связей при выделении экспланта.
• 3. Действие компонентов среды. Ауксины, особенно 2,4-Д – мутагены, цитокинины способствуют полиплоидизации.
• 4. Длительное субкультивирование, при котором накапливаются генетически измененные каллусные клетки.
• Генетическую гетерогенность клеток любой популяции не следует рассматривать как недостаток, более того, это, как правило, необходимое условие ее существования, основа адаптационных возможностей популяции.
• Одной из особенностей культуры клеток является физиологическая асинхронность – в каждый момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют.
Причины возникающей асинхронности:
• 1. Особенности вида, сорта, генотипа растения, особенности экспланта.
• 2. Стрессы культивирования (неоптимальная среда).
• 3. Изменение баланса эндогенных гормонов и концентрации в среде экзогенных гормонов в процессе выращивания.
• 4. Генетическая гетерогенность клеток и клонов.
• 5. Аномалии митотического цикла клеток in vitro.
• 6. Физические факторы (температура, свет, аэрация).
– К настоящему времени разработаны различные методы синхронизации клеток. Обычно для этого используют приемы, останавливающие клеточный цикл на границе его фаз. Например:
• 1) двукратное исключение из среды фосфора (в начале эксперимента и после определенного интервала времени);
• 2) введение в питательную среду 5-аминоурацила, который задерживает клетки на границе G1/S цикла, но и после удаления ингибитора деление клеток не начинается, пока в питательную среду не внесли фитогормоны.
• 3) использование 5-метилоксимочевины, которое наиболее удачно, данный подход позволяет накопить более 80% клеток на G1/S фазе клеточного цикла.
Морфотипы каллусных культур
• Например, для каллусных культур ячменя выявили семь основных морфологических типов клеток:
• 1) Гигантские, удлиненные, сильно вакуолизированные клетки, без явно выраженного ядра (200-400 мкм);
• 2) Молодые округлые паренхимные клетки без четко выраженного ядра (40-60 мкм);
• 3) Меристематические клетки (15-50 мкм);
• 4) Большие клетки с зернистой цитоплазмой и большими ядрами (50-100 мкм);
• 5) Мелкие меристематические клетки с сегментированным типом деления (15-20 мкм);
• 6) Трахеиды;
• 7) Паренхимные клетки.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему