Дифференцировка каллусных тканей.

Дедифференцировка – это возращение клеток в меристематическое состояние, при котором они сохраняют способность к делению.

После завершения дедифференцировки дальнейшее развитие каллусной клетки может идти в нескольких направлениях.

       Во-первых, это вторичная дифференцировка разной степени сложности.

        Во-вторых, в клетке может сформироваться состояние стойкой дедифференцировки («привыкание»), а следовательно, способность расти на безгормональной среде.

       В-третьих, каллусная клетка проходит свой цикл развития, завершающийся ее старением и отмиранием.

Наибольший интерес вызывает первый путь, фактически представляющий морфогенные процессы.

 В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток.

— Морфогенез - в культуре in vitro – это реализация генетической программы клетки в результате заложения, роста и развития органов, тканей и клеток у растений.

Пути морфогенеза in vitro могут быть классифицированы следующим образом:

1.                     Наиболее простой тип дифференцировки каллусной клетки это образование в каллусной ткани отдельных дифференцированных клеток, которые имеют определенное строение и выполняют специфические функции. Примером служит образование эпибластов — клеток, в которых запасаются вторичные метаболиты.

2.  Более сложная гистологическая дифференцировка завершается образованием в каллусе различных тканей: млечников, волокон, трихом, элементов ксилемы (трахеи и трахеиды) и флоэмы (ситовидные трубки и клетки-спутницы). К самым сложным видам вторичной дифференцировки относятся органогенез — образование органов и соматический эмбриогенез — образование из соматических клеток эмбриоидов, биполярных зародышеподобных структур. Все эти типы дифференцировки возможны только благодаря тотипотентности: любая растительная клетка содержит полный набор генов, характерный для того организма, из которого она была выделена. Потенциальные возможности всех клеток этого растения одинаковы; каждая из них в определенных условиях может дать начало целому организму.

Однако выяснено, что реально детерминируется только одна из 400—1000 клеток, что, вероятно, связано с физиологическим состоянием клетки, с ее компетентностью. Так, у эксплантов стеблевого происхождения компетентны к действию экзогенных фитогормонов и, следовательно, способны к морфогенезу только клетки эпидермальных и субэпидермальных тканей (Тран Тан Ван, 1981). Однако компетентность клеток может приобретаться ими в процессе культивирования каллусной ткани, в условиях, индуцирующих морфогенез. Время в течение которого в каллусных клетках возникает это свойство' изменяется в широких пределах. Кроме того, существенную роль в дифференциации играют генотип растения-донора, условия и физические факторы культивирования.

Все каллусные клетки, готовые ко вторичной дифференцировке, т. е. детерминированные, характеризуются общими чертами. Эти клетки — «клетки-инициали»— образуют утолщенную клеточную стенку, обособляясь от остальных каллусных клеток. Для них характерно более крупное ядро, большее количество запасных веществ, меньшие размеры вакуолей. В «клетках-инициалях» начинается синтез определенных белков, интенсифицируется пенто-зофосфатный путь расщепления гексоз. Очень важно, что между этими клетками, формирующими меристематические очаги, восстанавливаются плазмодесмы, которые практически отсутствуют в массе каллусных клеток.

 Л. Саксом и С. Тойвоненом еще в 1963 г высказали мнение о том, что существует минимальная масса каллусных клеток, которая определяет способность уже детерминированных клеток к дальнейшему морфогенезу. Это подтвердилось в опытах с культурой семядолей ели: детерминация адвентивных побегов происходила в клеточных комплексах из 5 — 6 клеток (Б.С.Флинн и др., 1988). В исследованиях С.Номура и А. Комамине (1989) было показано, что развитие соматических зародышей детерминируется в 6— 10-клеточном агрегате.

2. Гистогенез – образование тканей.  При культивировании каллусных культур часто наблюдается процесс, при котором дифференциация заканчивается на уровне тканевой организации (сосудистые элементы ксилемы (трахеи и трахеиды) и флоэмы (ситовидные трубки и клетки-спутницы). Если дифференциация в каллусной ткани заканчивается гистогенезом, то получить другие формы морфогенеза уже не удается. В таком случае процесс развития тканей – гистогенез является независимым и самостоятельным и представляет собой один из путей морфогенеза.  

Главную роль в преобразовании каллусных клеток в сосудистые элементы играют фитогормоны, в основном ауксины. Опыты по влиянию апикальной меристемы побега (место синтеза ауксинов) на гистогенез в каллусной ткани показали, что ниже места прививки апекса в каллусной ткани начинали образовываться сосудистые элементы. Тот же эффект наблюдался при нанесении на каллус ауксина с сахарозой. Интересно, что повышение концентрации сахарозы способствовало образованию элементов флоэмы, а понижение — образованию ксилемных элементов. Причем такое действие оказывала совместно с ауксином только сахароза, что позволяет говорить о ее регуляторной роли. Добавление к гормону других Сахаров гистогенеза не вызывало. В некоторых случаях стимуляторами гистогенеза помимо ауксинов могут быть и остальные фитогормоны. Так, было отмечено, что в каллусных тканях сои этот процесс начинается под действием гиббе-релловой кислоты и этилена.

3. Органогенез – появление и рост побегов из каллуса или инициация и рост побегов из пазушных почек, развивающихся на культивируемых верхушках побегов и образовавших впоследствии адвентивные корни (гемморизогенез).

•         В условиях in vitro может осуществляться геммогенез - образование почек, и ризогенез – образование корней.

•         Редким явлением является флоральный геммогенез – образование цветочных почек, характеризующихся закладкой тычиночных бугорков и завязи.

•         Образование побегов может происходить путем развития пазушных почек экспланта или путем организации de novo меристемы побегов в каллусных культурах.

Масса клеток, возникшая из детерминированных клеток, называется меристематическим очагом, если затем в ней дифференцируются зачатки стебля или корня.

•         Первое сообщение, касающееся индуцированного формирования побегов in vitro, принадлежит Уайту (1939). Он показал, что каллусная ткань гибрида Nicotiana glauca и Nicotiana langsdorfii формирует побеги при помещении на жидкую среду, тогда как при культивировании на агаризованной среде она не способна к органогенезу. В том же году Нобекорт сообщил о формировании корней в каллусной культуре моркови. Наблюдение Уайта было подтверждено и продолжено Скугом (1944), который показал, что ауксины могут стимулировать корнеобразование и ингибировать побегообразование.

•         Открытие кинетина привело к классическому открытию Миллера и Скуга гормональной теории  (1957), суть которой заключается в том, что баланс между ауксинами и цитокининами является регуляторным механизмом, лежащим в основе органогенеза. Оба эти вещества необходимы для клеточного деления и пролиферации каллуса табака, причем относительно высокий уровень ауксина по отношению к цитокинину способствует корнеобразованию, смещение гормонов в другую сторону вызывает побегообразование. Согласно сводке Мурасиге (1984) воспроизведение растений через органогенез описано более чем для 3000 видов.

Формирование органов в каллусных культурах включает несколько фаз:

•         Первая фаза органогенеза – переход недифференцированной растущей ткани к образованию регенерационной меристемы и закладке точек роста. На этой фазе осуществляется детерминация пути развития (геммогенез или ризогенез) и дифференциация зачатков органов.

Во время второй фазы возникшие почки и корни переходят к активному росту.

•         Формирование меристематических очагов в каллусных культурах происходит хаотично. Однако в каллусной ткани табака меристематические очаги, а затем и стеблевые структуры были локализованы на некотором расстоянии от поверхности агаризованной среды, но всегда только в нижней части каллусной ткани. Возможно, такая локализация очагов связана с определенным градиентом факторов, необходимых для геммогенеза.

•         Для ряда культур показано, что меристематические очаги, из которых формируются почки, располагаются на поверхности каллуса (экзогенно), а те, из которых формируются корни – закладываются в толще каллуса (эндогенно).

•         Характерным свойством меристематических очагов является их пластичность – способность к образованию, как почек, так и корней. Направление развития меристематического очага определяется эффектом минимальной массы – необходимым количеством детерминированных клеток.

•         В разных системах минимальное количество клеток, необходимое для развития, различно.

•         Существенным аспектом органогенеза является установление контактов между клетками меристематического очага.

•          Если каллусная клетка во многих отношениях существует сама по себе, то в клетках организующихся структур повышается число плазмодесм, связывающих клетки между собой. Существующая организация внутри- и межклеточного транспорта, очевидно, может определять поляризацию структур, образующихся в каллусных культурах.

•         Возникающие в каллусных культурах почки являются монополярными структурами, имеющими тесную связь с материнской каллусной тканью. Поэтому для получения целого растения поэтапно используют среды, обладающие различными индуктивными свойствами. Для этого осуществляют последовательное культивирование каллуса сначала на среде для геммогенеза, а затем – для ризогенеза.

•         Фороци-Вер выдвинул положение о существовании генетического фактора, определяющего экспрессию регенерационного признака. Это экспериментально подтверждено в опытах по изучению наследования признака регенерации растений из каллусной ткани.

•         Каллусные культуры, полученные из гибридного растения, один из родителей которого обладал высокой регенерационной способностью, характеризовались интенсивным образованием побегов. Более того, у гибридных форм ячменя наблюдался своеобразный гетерозисный эффект по способности к регенерации.

•         Тупиковым типом органогенеза, не приводящим к регенерации растений, является ризогенез.

•         4. Соматический эмбриогенез - это процесс дифференциации диплоидных и гаплоидных клеток в целое растение без слияния гамет.

•         1) Эмбриогенез, или культура зародышей, представляет собой стерильную культуру зиготических зародышей. Зародыш изолируют из семени или семяпочки и помещают в искусственные условия, заменяющие эндосперм (т.е. на питательную среду). Последующее развитие и прорастание зародыша происходит так же, как это было бы в семени (рис. 15).

2) Соматический эмбриогенез, или эмбриоидогенез представляет собой процесс формирования зародышевых структур из соматических клеток. Соматический зародыш (эмбриоид) – это независимая двухполюсная структура, не соединенная сосудами с тканью, из которой происходит. Возникает эмбриоид из глобулярного проэмбрио. Такие зародыши в дальнейшем могут развиваться и прорастать в регенеранты через стадии, соответствующие тем, что встречаются при развитии зиготы.

•         Структурной единицей соматического эмбриогенеза (эмбриоидогенеза) является соматический зародыш или эмбриоид.

•         Эмбриоиды in vivo могут возникать на разных структурах и органах: из зиготы и зародыша (монозиготическая эмбриоидогения), из клеток нуцеллуса (нуцеллярная), интегументов (интегументальная), листа (флоральная) и корня (ризогенная).

•         В культуре тканей эмбриоиды развиваются как из соматических клеток (например, эпидермиса или паренхимы), так и из неоплодотворенных гамет или тканей, естественно связанных с процессом эмбриоидогенеза in vivo (например, тканей нуцеллуса).

•         Соматический эмбриогенез с точки зрения биотехнологии имеет много преимуществ перед органогенезом. Регенерант на основе соматического зародыша полностью сформирован, тогда как побеги, полученные в результате органогенеза, надо укоренять, а лишний труд неэкономичен для биотехнологии.

•         Инициация и развитие эмбриоидов из соматических тканей в культуре растительных клеток были впервые описаны Стюардом (1958) и Рейнертом (1958, 1959) для культуры Daucus carota.

•         Начиная с этого времени работы по эмбриоидогенезу проводились достаточно интенсивно, и в 1979 г. Тиссерат описал эмбриоидогенез для 32 семейств, 81 рода, 132 видов.

•          Развитие эмбриоидов у двудольных и однодольных растений, так же как и развитие зиготических зародышей у этих классов покрытосеменных растений, имеет свои особенности (рис. 22).