Опыты по трансгенозу в случае овец и коз в основном были направлены на превращение молочных желез этих животных в своеобразные биореакторы для получения белковых продуктов, использующихся в медицине. Несмотря на то что надои у овец и коз меньше, чем у коров, за год они дают сотни литров молока. С помощью метода, аналогичного используемому для создания трансгенных мышей и трансгенных конструкций, содержащих гены человека под контролем промоторов, специфичных для молочных желез, были созданы трансгенные овца и коза, в молоко которых секретировались белки человека. Они были гликозилированы и обладали активностью, близкой к таковой соответствующих белков, получаемых от человека. Однако, для того чтобы убедиться в полной эквивалентности этих белков, нужны дополнительные исследования. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не оказывала никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемое потомство.
В отличие от этого при введении свиньям трансгена бычего гормона роста под контролем промотора металлотионеина неблагоприятные эффекты наблюдались. Количество гормона у разных особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта группа быстрее прибавляла в весе. К сожалению, этот положительный результат частично обесценивался различными патологиями: у животных отмечались язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к пневмонии. Причины этих симптомов неизвестны. Возможно, они связаны с долговременным присутствием в организме избытка гормона роста.
На основе схемы получения трансгенных мышей разработана методика получения трансгенных сельскохозяйственных животных, в частности для свиней она включает следующие основные этапы:
1. Получение оплодотворенных яйцеклеток. Для микроинъекции чужеродного гена необходимо иметь оплодотворенные яйцеклетки в стадии формирования пронуклеусов. Для вызывания суперовуляции инъецируют до 1500 ME СЖКII через определенный интервал - до 1000 ME XT - хорионический гонадотропин. Первый гормон стимулирует рост и развитие фолликулов, второй вызывает овуляцию. Через 24-36 ч доноров осеменяют. Зиготы и ранние эмбрионы извлекают через 60-6Зч после индуцирования полиовуляции. Рога матки промывают фосфатным буфером Дюльбекко. Для выявления пронуклеусов проводят дозированное центрифугирование, чтобы осадить гранулы, покрывающие пронуклеус.
2. Конструирование гена. Типичный ген эукариот состоит из двух основных частей: регуляторной и информативной (кодирующей или структурной). С помощью методов генной инженерии удаляют всю регуляторную часть гена и заменяют ее регуляторным участком - промотором бактора бактериального гена и структурной части эукариотического гена.
3. Приготовление инъекционного раствора ДНК. Иньецируемый раствор ДНК освобождают от партикулярных загрязнений. Приготовленный иньекционный раствор повторно центрифугируют 30 мин., чтобы полностью очистить от примесей.
4.Микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы. Для переноса чужеродных генов в пронуклеус зиготы сельскохозяйственных животных используют инверсионный микроскоп, два микроманипулятора, инъекционный сосуд, инъекционную пипетку и пипетку - держатель.
Зиготу фиксируют гашеткой - держателем. Инъекционную пипетку наполняют раствором ДНК из инъекционного сосуда. С помощью направляющего рычага инъекционную пипетку вводят через зону пеллюцида, плазматическую мембрану и мембрану ядра в мужской пронуклеус. Инъекция 1-2 пл. раствора ДНК приводит к увеличению объема мужского пронуклеуса до 50%. Инъецированные яйцеклетки переносят в свежую питательную среду, где их культивируют до трансплантации в течение 1-2 ч.
5.Трансплантация зигот. После инъецированные зиготы отбирают. В большинстве экспериментов жизнеспособными будут 80-90% инъецированных зигот, которые можно трансплантировать в яйцевод реципиентов.
6. Выявление интеграции чужеродной ДНК. Для выявления интеграции генов у новорожденных животных берут образцы тканей (с кончика хвоста, кровь). Из ядросодержащих клеток образца ткани извлекают высокомолекулярную геномную ДНК. После расщепления такой ДНК рестрикционными ферментами фрагменты ДНК разделяют на горизонтальном электрофорезе в агарозном геле. Разделенные фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию радиоактивным зондом, имеющим гомологичные последовательности ДНК. На полученном радиоавтографе будут видны только те радиоактивные полосы, которые имеют гомологичные с зондом последовательности. Таким образом, с помощью метода блот-гибридизагии можно определить, что инъецированный ген интегрировался в геном исследуемой клетки.
Данную схему можно использовать для получения не только свиней, но и других видов сельскохозяйственных животных.
Были созданы также трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Для этого к ДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста I была помещена под контроль мышиного промотора гена кератина с высоким содержанием серы, что обеспечивало гиперэкспрессию ДНК. При этом у трансгенных овец никаких нежелательных побочных эффектов не наблюдалось.
Положительные результаты были получены и в ходе экспериментов с трансгенными свиньями. Например, были созданы здоровые трансгенные свиньи, в геноме которых присутствовала следующая генетическая конструкция: регуляторная область гена β-глобина человека, два гена α1-глобина человека и один ген βА-глобина человека. В результате ее экспрессии в клетках крови свиней синтезировался человеческий гемоглобин, при этом в результате замены человеческого промотора гена β-глобина свиным человеческий гемоглобин синтезировался в значительно большем количестве. Человеческий гемоглобин, продуцируемый трансгенными свиньями, обладал такими же химическими свойствами, что и природный человеческий. Его можно было очистить от гемоглобина свиней обычной хроматографией.
Эти результаты указывают на принципиальную возможность замены цельной крови, используемой при трансфузии, человеческим гемоглобином, полученным методом трансгеноза. Однако изолированный гемоглобин переносит кислород не так эффективно, как гемоглобин в составе эритроцитов. Более того, он быстро разрушается в организме животного, которому был введен, а продукты его распада токсичны для почек. Таким образом, получение заменителя человеческой крови с помощью трансгеноза - это дело далекого будущего.
В последнее время большое внимание уделяется вопросу об использовании органов животных для трансплантации человеку. Основная проблема межвидовой трансплантации — это гиперострое отторжение. Гиперострое отторжение влечет за собой связывание антител организма-хозяина с углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного органа. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию (активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель несущих антитела клеток и быстрая потеря пересаженного органа.
В естественных условиях воспалительная реакция блокируется особыми белками на поверхности клеток, выстилающих стенки кровеносных сосудов. Эти белки — ингибиторы комплемента видоспецифичны. Было высказано предположение, что если бы животное-донор несло один или несколько генов человеческого белка, ингибирующего комплемент, то пересаженный орган был бы защищен от первичной воспалительной реакции. С этой целью были получены трансгенные свиньи, несущие различные человеческие гены ингибитора комплемента. Клетки одного из этих животных оказались совершенно нечувствительными к компонентам системы каскада комплемента. Предварительные эксперименты по пересадке органов трансгенных свиней приматам показали, что ткани пересаженного органа повреждаются слабее, а сам орган не отторгается немного дольше. Возможно, трансгенные свиньи, несущие человеческий ген ингибитора комплемента и лишенные основного поверхностного белка клеток свиней, который вызывает острейшее отторжение, будут служить источником органов для трансплантации человеку.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему