Рестриктазы

Рестриктазы, эндодезоксирибонуклеазы – ферменты, которые узнают в ДНК определённые специфические для каждого фермента последовательности нуклеотидов и расщепляет их, если она не модифицирована в этих же участках сайт-специфическими метилазами. Уже описано около 2500 рестриктаз, выделенных из разных микроорганизмов. Модификация заключается в метилировании ферментом ДНК-метилазой определённых оснований в последовательности, узнаваемой сопряжённой рестриктазой; тем самым обеспечивается защита данного участка ДНК от воздействия рестриктазы. Одновременное наличие в клетке этих двух ферментативных активностей (так называемая R-M система) препятствует гидролизу собственной нуклеиновой кислоты. Но при проникновении в бактериальную клетку чужеродной ДНК, например бактериофага, эта ДНК служит субстратом для обоих ферментов. Следовательно, часть вирусной ДНК разрушается, а часть метилируется, тем самым становясь «непреступной» для рестриктаз. Первоначально считали, что функцией R-M систем является защита клеток от инфицирования фагами. Но позже сделали предположение о том, что R-M система осуществляет функцию ограничения скрещивания между различными бактериальными видами и штаммами, которая, однако, не абсолютна и позволяет части чужеродной ДНК поступать в клетку и встраиваться в ДНК бактерии. Открытие большого числа рестриктаз и изучение их свойств позволило выявить некоторые закономерности функционирования ферментов и разделить их на три класса. Основой классификации служат в первую очередь потребность фермента в кофакторах и характер расщепления ДНК.

Рестриктазы класса I. Они обладают следующими свойствами: требуют в качестве кофакторов аденозинтрифосфат (АТФ), S-аденозинмонофосфат (SAM), ионы Mg2+. В едином субъединичном мешке имеются такие ферментативные активности, как расщепление ДНК, его метилирование и узнавание специфической последовательности ДНК. Они узнают строго специфичные участки ДНК, но разрыв цепи происходит случайным образом на расстоянии 400-7000 пн (пар нуклеотидов), а продукты расщепления ДНК гетерогенны.

Рестриктазы класса II. Системы R-M класса II состоят из отдельных белков, что упрощает их изучение и использование для расщепления молекул ДНК. Рестриктазы этого класса – относительно просто организованные белки. Их отличительной чертой является то, что они узнают и разрезают ДНК по специфичным нуклеотидным последовательностям длинной от 4 до 8 пн, и в результате образуется дискретный набор фрагментов ДНК. В качестве кофакторов рестриктазам класса II необходимы только ионы Mg2+. В результате расщепления ДНК (рис.2), ряд ферментов образуют фрагменты с тупыми концами, не имеющие выступающих одноцепочечных участков, а другие расщепляют с образованием высококомплементарных одноцепочечных липких концов (как 5’-концов, так и 3’-концов). Важно, что при смешивании фрагментов с комплементарными липкими концами в определённых условиях они могут реассоциировать (слипаться). Все эти свойства сделали рестриктазы класса II наиболее часто используемыми при конструировании гибридных молекул ДНК.

Рестриктазы класса III имеют некоторые сходства в строении с рестриктазами класса II. Они узнают несимметричные последовательности длиной 5-6 пн и расщепляют ДНК в стороне от участков узнавания на расстоянии 24-27 пн, образуя одноцепочечные 5’-концы длиной 2-3 нуклеотида. Для проявления активности им требуются АТФ, SAM, ионы Mg2+. При действии ферментов данного класса in vitro не удаётся исчерпывающе гидролизовать ДНК, что является их отличительной особенностью.

Рестриктазы широко распространены в царстве прокариот, как в аэробах, так и в анаэробов. Но есть штаммы, которые не содержат R-M систем, иногда их называют «нулевыми». Рестриктазы были найдены и в зиготах хлореллоподобной водоросли, которые осуществляли гидролиз хлоропластной ДНК, исходя из этого можно предположить, что хлоропласты произошли из цианобактерий.