Рестриктазы осуществляют расщепление ДНК, значит, существует фермент, воссоединяющий фрагменты молекулы ДНК. В 1967 г. независимо в нескольких лабораториях был открыт фермент, названный ДНК-лигазой, который катализирует синтез фосфодиэфирной связи между 5’-фосфатным (5’-р) и 3’-гидроксильным (3’-ОН) концами в двуцепочечной ДНК. Были обнаружены два типа ДНК-лигаз: один фермент синтезируется в клетках E.coli, другой же фермент, появляется в клетках E.coli при их инфицировании фагом Т4. Данные ферменты различаются по потребности в кофакторах. ДНК-лигаза E.coli в качестве кофактора требует дифосфопиридиннуклеотид, в то время как лигаза фага Т4 – АТФ, а также она способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Поэтому в генно-инженерных экспериментах предпочитают использовать ДНК-лигазу фага Т4, как более универсальный фермент.
Возможны два типа реакций синтеза фосфодиэфирной связи:
1. Лигирование липких концов. Соединение фрагментов ДНК с полностью комплементарными липкими концами. Частным случаем такой реакции является лигирование ника (nick) – разрыва в одной из нитей двухцепочечной ДНК.
2. Лигирование тупых концов. Таким образом, ДНК-лигаза фага Т4 обеспечивает ковалентное соединение любых двухцепочечных фрагментов ДНК, для которых имеется возможность состыковать 5’-р и З’-ОН концы. Поэтому она является одним из важнейших ферментов, на использовании которых основаны современные методы рекомбинации молекул ДНК in vitro.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему