Основной метод изучения мутационного процесса — определение его частоты. При этом экспериментаторы следуют правилам, которые были сформулированы Н. В. Тимофеевым-Ресовским (1934):
1. Работа возможна только с генетически чистым материалом, т. е. инбредными или чистыми линиями, гомозиготными по исследуемым генам.
2. Необходимо оперировать достаточно большими численностями как в контроле, так и в обработанном мутагенами материале.
3. Для регистрации возникающих мутаций следует применять удобные генетические методы.
4. Анализировать любые полученные изменения, с тем чтобы установить наследственны ли они (цитоплазматические или ядерные, хромосомные или генные).
5. Требуется знание способа действия мутагена на зародышевые клетки обработанного организма.
Эти правила касаются изучения индуцированного мутационного процесса, и его частоту обычно определяют, вычитая частоту мутаций, возникающих в контрольном варианте (без обработки), из частоты мутаций в опытном варианте (после обработки мутагеном).
Учет мутаций у микроорганизмов. Такой эксперимент достаточно просто провести на гаплоидных микроорганизмах, у которых каждая клетка на плотной среде может образовать отдельную колонию, представляющую собой клон, и все эти клоны проверяют по интересующему признаку.
Если исследуют мутации, дающие селективное преимущество, то мутантов легко выявить методом отпечатков, или реплик, предложенным Э. и Дж. Ледерберг (рис. 12.2). Например, при изучении мутаций устойчивости Е. coli к бактериофагу T1 (мутанты Топг) клетки бактерии высевают на агаризованную среду в чашки Петри таким образом, чтобы на них образовались отдельные колонии. Затем при помощи бархатной печатки эти колонии перепечатывают на чашки с нанесенной суспензией частиц фага Т1. Большая часть клеток исходной (чувствительной) культуры (Топ) не будет образовывать колоний, поскольку их лизирует бактериофаг. Вырастут лишь отдельные мутантные колонии (Топг), устойчивые к фагу. Сравнивая частоту мутантов в контрольном и опытном (например, облученном ультрафиолетовым светом) вариантах, легко определить частоту индуцированных мутаций.
В то же время метод отпечатков незаменим при учете мутантов, теряющих способность к росту на каком-либо субстрате, например ауксотрофных по гистидину. Тогда колонии, выросшие на полноценной среде, перепечатывают на чашки со средой без гистидина и отыскивают те, отпечатки которых на этой среде не способны к росту. Затем сравнивают их частоты в контрольном и опытном вариантах.
Современные методы определения частоты спонтанного мутирования представляют собой модификации подхода, использованного С. Лурия и М. Дельбрюком (1942). Эти авторы впервые исследовали распределение числа мутантных клеток в параллельных клонах — бактериальных культурах. Рассмотрим один из вариантов определения частоты спонтанного мутирования на конкретном примере исследования мутаций: Ade => Ade+ у мутанта по гену adel дрожжей-сахаромицетов. Этот пример удобен тем, что колонии, образуемые исходной культурой, красные и нуждаются в аденине. Мутанты же (в данном случае ревертанты) белые и в аденине не нуждаются. Это позволяет для выявления мутантов применять селективный метод.
Прежде всего нужно узнать распределение спонтанных мутантов среди клонов, содержащих одинаковое число клеток. В данном случае удобнее всего использовать предложенный Н. Н. Хромовым - Борисовым метод упорядоченного посева на среде, полуобогащенной ограничивающим фактором роста.
Капли суспензии исходной культуры равного объема наносят специальным репликатором на плотную среду, содержащую количество аденина, необходимое для нескольких делений клеток ade 2. Благодаря тому, что штыри репликатора (рис. 12.4, А) расположены в углах правильной тригональной решетки, все колонии оказываются на равном расстоянии друг от друга и имеют одинаковый размер, а следовательно, и число клеток. Вариабельность не превышает 1 %. После прекращения роста колоний из-за истощения аденина в среде на них появляются колонии вторичного роста, или «бородавки» мутантов Ade+. Они образуются в результате продолжающихся делений мутантных клеток, не нуждающихся в аденине. Белые бородавки Ade+ хорошо заметны на фоне красных колоний Ade~.
Тогда частоту мутаций (m) в пересчете на клетку за одно клеточное деление вычисляют по формуле m = (X*ln2)/N, где X — среднее число бородавок на одну колонию, N — среднее число клеток в колонии.
Учет мутаций у дрозофилы. Изучение мутационного процесса, особенно спонтанного мутирования у высших организмов — растений и животных — затруднено в связи с ограниченным числом особей, которых можно исследовать, а также в связи с их диплоидностью, препятствующей непосредственному проявлению рецессивных мутаций.
Наиболее удобные методы учета мутаций разработаны для дрозофилы (D. melanogaster). Собственно именно создание методов учета рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме определило успех Г. Меллера, открывшего действие рентгеновых лучей на мутационный процесс у дрозофилы. Для учета рецессивных летальных мутаций, сцепленных с полом, у дрозофилы широко применяют метод Меллер-5 (рис. 12.5). Самки линии Мел- лер-5, или М-5, несут в обеих Х-хромосомах по две инверсии: sc8 и б 49. Инверсия sc8 захватывает почти всю Х-хромосому, а в ее пределах находится еще одна инверсия — 8 49. В этой системе кроссинговер полностью подавлен. Используемые инверсии не имеют рецессивного летального действия. Кроме того, обе хромосомы М-5 несут три маркера: два рецессивных — (абрикосовый цвет глаз) и sc8 (укороченные щетинки — фенотипическое проявление одноименной инверсии, затрагивающей ген sc) и один доминантный — Ваг.
При скрещивании исследуемых самцов с самками М-5 в индивидуальных семьях F, получают по два класса самок и самцов, если в Х-хромосоме сперматозоидов исходного самца не возникла рецессивная летальная мутация. Если же рецессивная леталь появилась, то в соответствующей индивидуальной культуре в F2 мы получим только один класс самцов, будут отсутствовать самцы дикого типа w+ В+.
Метод Меллер-5 можно использовать и для регистрации рецессивных мутаций в Х-хромосоме с видимым проявлением. Для этой цели удобнее применять метод double yellow, основанный на скрещивании исследуемых самцов с самками, несущими сцепленные Х-хромосомы. Благодаря тому, что при таком скрещивании сыновья получают свою Х-хромосому непосредственно от отца, рецессивные мутации в этой хромосоме можно учитывать уже в F1.
Учет летальных мутаций и мутаций с видимым фенотипическим проявлением легче удается для Х-хромосом дрозофилы благодаря специфике ее наследования. Однако существуют методы учета летальных мутаций в аутосомах. Например, для учета рецессивных летальных мутаций в хромосоме 2 используют так называемый метод сбалансированных леталей. Для этого применяют линию, гетерозиготную по хромосоме 2. В одном гомологе находятся доминантные гены Cyrly (Су — загнутые крылья) и Lobe ( L — уменьшенные глаза лопастной формы), в другом гомологе— Plum (Pm — сливово-коричневый цвет глаз). Кроме того, хромосома Су L содержит инверсии, препятствующие кроссинговеру. Все три доминантные мутации обладают рецессивным летальным действием. Благодаря этому при разведении такой линии выживают только гетерозиготы по указанным генам. Это и есть система сбалансированных леталей.
Для изучения рецессивных летальных мутаций, а также рецессивных мутаций с видимым проявлением исследуемых мух скрещивают с мухами CyL/Pm. В F получают мух, гетерозиготных по той или другой хромосоме исследуемой линии, и индивидуально вновь скрещивают сегрегантов CyL с мухами CyL/Pm. В F2 (в индивидуальных культурах) скрещивают между собой самцов и самок с признаками CyL и анализируют F3. В отсутствие рецессивной летальной мутации расщепление в F3 будет 2CyL : 1 Су+ L, а если в половых клетках мух исходной линии возникали летальные мутации, то в соответствующих индивидуальных культурах в F3 не будет нормальных мух 2CyL :0 Cy+L+. Аналогично учитывают в и рецессивные мутации с видимым проявлением в хромосоме 2.
Учет рецессивных мутаций у высших растений удобнее всего проводить на самофертильных формах, к которым относятся прежде всего самоопыляющиеся виды. У них после обработки мутагенами семян или пыльцы закладывают индивидуальные линии и в /г (так называют второе поколение, полученное от самоопыления). Мутации у самосовместимых видов растений изучены лучше, чем у самонесовместимых форм, размножающихся перекрестным опылением. В последнем случае закладке индивидуальных (самоопыляющихся) линий должен предшествовать этап скрещивания с самофертильными мутантными формами, которые получены у ряда перекрестно опыляющихся растений. Этот принцип впервые был применен В. Г. Смирновым и С. П. Соснихиной для анализа наследственной изменчивости в популяциях ржи.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему