Синтез гена в лаборатории. Основные этапы генной инженерии. Значение.

Генная инженерия – генетическая инженерия на клеточном уровне, связана с целенаправленным созданием in vitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клетке хозяина и синтезировать требуемый продукт.

Объединяет в себя моменты получения отдельных генов и введения их в геномы других организмов с целью изменить фенотип последнего.

Основные этапы процесса генной инженерии:

1)      Выделение нужного гена из клетки донора или искусственный его синтез;

2)      Присоединение гена к молекуле ДНК (вектору), способной ввести его в клетку реципиента;

3)      Включение гена в геном клетки реципиента (трансформация);

4)      Активация гена и появление нужного признака в фенотипе клетки – реципиента;

5)      Клонирование трансформированных бактерий, для получения продукта в промышленном масштабе (биотехнология)

Механизмы получения нужных генов:

1)      Химический синтез гена

2)      Выделение комплементарной гену мРНК для получения на ее основе ДНК – реплики (процесс обратной транскрипции)

3)      Непосредственное выделение гена из клетки донора. Далее следует клонирование гена

Этапы искусственного химического синтеза гена:

1)      Секвенирование гена ( метод Сенгера):

a)      Денатурация ДНК до одиночных цепей

b)      Присоединение праймера (затравки)

c)      Обработка смесью и 4 нуклеотидов и 1 дезоксинуклеотида (проведение 4 опытов)

d)     Разделение цепей разной длины в электрофорезе и установление их размера.

Метод Максама – Гилберта (мечение н – ов радиактивными изотопами и выявление их положения с помощью радиоантографии)

2)      Химический синтез коротких фрагментов

3)      Сшивка фрагментов с получением гена.

Гены соматотропина, интерферона, инсулина.

Обратная транскрипция гена:

1)      Выделение нужной иРНК (у эукариот – пре-иРНК) из ткани, в которой данный ген наиболее активен

2)      Добавление к иРНК обратной транскриптазы

3)      Выделение нужной ДНК – реплики (Пр: глобины человека, яичный белок, фибрин шелка)

Методы выделения гена из генома донора:

1)      Фрагментация ДНК донора с помощью рестриктаз (более 400 видов). Каждая действует строго специфично, разрезая определенные последовательности нуклеотидов. Часто 2 цепи разрезаются неравномерно  с образованием «липких концов»

2)      Объединение фрагментов ДНК донора с вектором  с получением гибридной ДНК

3)      Введение гибридного вектора в клетку – реципиент  с помощью трансформации

4)      Выделение клеток

Вектор – это молекула ДНК, способная переносить клонируемые гены в клетку реципиент, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом.

Векторы содержат:

1)      Участок встраивания чужеродной ДНК

2)      Маркерный ген (или гены). Один является маркером встраивания гибридной ДНК в вектор (инактивируется), другой – маркером трансформации вектора в клетку бактерий.

3)      Сайт инициации транскрипции в клетке – доноре

Типы векторов:

1)      Плахмидные (Ti – плазмида)

2)      Фаговые (фаг – лямбда)

3)      Кослеидные (гибриды плазмид и фагов)

4)      Челночные (имеют сайты транскрипции прокариот и эукариот)

5)      Хромосомные (у дрожжей)

6)      При создании гибрибной ДНК геном донора и вектор разделяют одной рестриктазой и сшивают впоследствии ДНК – лигазой

Трансформация вектора с геном в клетку донора

1)      Трансформация (трансфекция)

2)      Микроинъекция

3)      Упаковка в липосомы

4)      Бомбардировка микрочастицами

5)      При встраивании вектора, инактивируется маркерный ген и бактерии погибают на среде без АМК, которую этот ген кодировал или в присутствии антибиотика, резистентность к которому ген определял