Методы клонирования ДНК: клонирование ДНК in vivo, амплификация ДНК in vitro

 Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход предполагает использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro.
Клонирование ДНК in vivo Клонирование ДНК in vivo включает 6 этапов: 1) получение фрагментов ДНК, в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции; 2) рекомбинация фрагментов, 3) вставка фрагмента ДНК в вектор; 4) трансформация с помощью вектора организма хозяина; 5) скрининг на рекомбинантный вектор 6) отбор интересующих исследователя клонов.

Полимеразная цепная реакция
В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - искусственная амплификация последовательности ДНК путем повторных циклов репликации и разделения нитей.
Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то ферментная метка будет накапливаться при амплифицировании. Продукт амплификации проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается изменение окраски. В качестве метки можно использовать стрептавидин. Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В последнем случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к обычным, идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим достигается еще большее усиление сигнала.
Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3—4 часа, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного фрагмента ДНК в составе векторных молекул.