Главнейшие этапы процесса молекулярного клонирования
Процесс молекулярного клонирования in vivo (в живых клетках) включает следующие этапы:
получение целевого фрагмента ДНК -> выбор вектора –> создание рек-ДНК –> выбор хозяина -> введение вектора в популяцию восприимчивых клеток хозяина –> отбор успешно трансформированной (трансгенной) клетки -> размножение данной клетки -> выделение векторных молекул из клетки –> выделение целевого фрагмента ДНК.
Клонирование в живых клетках является альтернативой амплификации фрагмента in vitro (в пробирке). Клонирование in vitro ведется с помощью полимеразной цепной реакции. При этом выделенный из клеток фермента ДНК-полимераза, находясь в среде определенной кислотности, ионной силы, при наличии ДНК-матрицы, строительных блоков (мононуклеотидов) и чередовании циклов денатурации-ренатурации ДНК, создает большое число копий целевого фрагмента ДНК. Удобное клонирование in vitro было изобретено относительно недавно, с открытием термостабильной ДНК-полимеразы бактерии Thermus aquaticus и с внедрением приборов, поддерживающих циклический температурный режим – термоциклеров. До внедрения таких приборов, клонирование in vitro производилось «вручную», т.е. с поочередным нагреванием реакционной смеси на водяной бане и охлаждением в холодильнике, повторяя цикл 15–20 и более раз.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему