Выделение ДНК и РНК

Этапы выделения ДНК и РНК

1.Разрушение клеток.

2.Отделение нуклеиновых кислот от белков, полисахаридов и др. соединений.

3.Осаждение нуклеиновых кислот.

4.Анализ чистоты препарата.

В зависимости от организма выделяют ДНК используя различные методы разрушения клеток:

1.Для разрушения клеток бактерий используют химические вещества, разрушающие клеточную стенку бактерий – лизоцим, ультразвук, гомогенизация и др. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия.

2.Разрушение клеток животных и человека: используют протеиназами.

3.Для разрушения клеточных стенок растений – ферменты, разрушающие целлюлозу, замораживание в жидком азоте и последующее механическое разрушение клеток и др. используют обработку  хелатирующими агентами, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счѐт связывания двухвалентных катионов.

2. Отделение нуклеиновых кислот от белков осуществляют :

- осуществляют с помощью фенола и хлороформа (белки переходят в фазу растворителя). смесь водонасыщенного фенола с хлороформом 1:1, а не кристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование.

белки разрушают протеиназами, например, протеиназой К;

-центрифугированием для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл.

Ряд современных методов предусматривает( осаждение ДНК на гранулах силикагеля добавл гуанидинтиоцианат).

3.Оставшиеся нуклеиновые кислоты в водном растворе осаждают  раствор этанолом и после  центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе.

4. Для оценки чистоты препарата ДНК, проводят измерения оптической плотности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов. Значение соотношения А260/280 для чистой ДНК должно быть больше 1,8. Значение А260/235 должно быть больше, чем 2,2.