Эксцизионную репарацию, т. е. связанную с удалением поврежденного участка ДНК, называют также репарацией по типу выщепления — замещения или более образно «механизм режь — латай». Наиболее подробно изучена именно репарация ДНК, содержащей тиминовые димеры. Появление димеров приводит к локальной денатурации ДНК, что влечет за собой нарушение процесса репликации: каждый тиминовый димер в ДНК Е. coli задерживает репликацию на 10 с.
Доказательство существования и изучение механизма эксцизионной репарации стало возможным благодаря получению мутантов Е. coli, чувствительных к летальному действию ультрафиолетового света. Если штаммы Е. coli, устойчивые к ультрафиолетовому свету, инкубировать в темноте после облучения, то из их ДНК удаляются тиминовые димеры. У мутантов, чувствительных к ультрафиолетовому свету, этого не происходит.
Эксцизионная репарация представляет собой многоэтапный процесс и заключается в: 1) «узнавании» димера, 2) надрезании одной цепи ДНК вблизи димера — инцизии, 3) удалении димера — эксцизии, 4) ресинтезе ДНК и 5) восстановлении непрерывности репарируемой цепи за счет образования ковалентных связей сахарофосфатного скелета молекулы.
«Узнавание» повреждения в ДНК осуществляет фермент УФ-эндонуклеаза, который реагирует не только на димеры тимина, но и на многие другие изменения, приводящие к локальному нарушению структуры ДНК. Эндонуклеаза ответственна и за инцизию, т. е. надрезание одной цепи ДНК (разрыв фосфодиэфирных связей) непосредственно около димера с 5'-конца в поврежденной цепи. Эксперименты in vitro с облученной ДНК показали, что число однонитевых разрывов оказывается равным числу димеров в молекуле.
Эксцизию, или вырезание димера из молекулы ДНК, осуществляет другая нуклеаза. Димер удаляется в составе короткого олигонуклеотида (3—5 оснований), что может сопровождаться дальнейшей деградацией поврежденной спирали. Продукты деградации облученной ДНК, содержащие тиминовые димеры, можно обнаружить в клетках. У некоторых бактерий димеры находили и в культуральной среде. Деградацию ДНК осуществляет АТФ-зависимая ДНКаза. В результате эксцизии и последующей деградации ДНК образуются однонитевые бреши, или пробелы.
Ресинтез ДНК, в результате которого заполняются бреши, идет с использованием в качестве матрицы интактной цепи. Такой репаративный синтез ДНК напоминает «дополнительную» репликацию, обнаруженную в пахитене у эукариот.
ДНК Е. coli метили 14С, выращивая клетки в присутствии радиоактивного тимина, а затем изучали репликацию в присутствии 5-бромурацила, меченного 3Н. В результате нормальной репликации при центрифугировании в градиенте плотности можно наблюдать смещение пика распределения молекул: при этом бромурацил играет роль плотностной метки. В соответствии с этим гибридные молекулы ДНК оказываются меченными 14С и 3Н. При изучении тем же методом ДНК, выделенной из облученных клеток, обнаруживали только один пик, соответствующий по плотности исходным молекулам. Тем не менее эти молекулы содержали как 14С, так и небольшое количество 3Н.
Этот пик радиоактивности появлялся вследствие включения 5-бромурацила в ДНК в ходе репаративного синтеза. Однако фрагменты ДНК, содержащие 5-бромурацил, столь невелики (в среднем пять нуклеотидов на один димер), что не влияют на плавучую плотность молекул, извлекаемых из клетки. Подтверждением предложенного объяснения наблюдаемой картины служило, во-первых, то, что фотореактивация снимала ресинтез ДНК: исчезал дополнительный пик радиоактивности 3Н; во-вторых, репаративный синтез не отмечался у мутантов, не способных выщеплять димеры тимина. Механизм синтеза ДНК, наблюдаемый в ходе репарации после ультрафиолетового облучения, получил наименование неполуконсервативного.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему