Способы соединения векторных молекул и клонируемых фрагментов.
Векторные молекулы и клонируемые фрагменты м. б. получены с использованием одной рестриктазы. Тогда они имеют одинаковые «липкие концы» и в присутствии ДНК-липаз они легко соединяются м/у собой по принципу коплементарности липких концов - лигирование.
Чаще их получают с разными рестриктазами, т. е. концевые фрагменты не комплементарны. Поэтому были разработаны 3 подхода их соединения.
Линкерный мол – короткая последовательность ДНК (6-12 пар оснований синтезированных искусственно), внутри себя содержат сайты узнавания для одной или нескольких рестриктаз. При использовании высоких концентраций фермента ДНК-лигаза, такие линкеры пришиваются с обеих сторон к клонируемому фрагменту. Затем такая ДНК обрабатывается этой рестриктазой, образуется однонитевые фрагменты, которые можно соединять с векторной молекулой, полученной этой же рестриктазой.
Полилинкеры – несколько сайтов узнавания рестриктаз.
Адаптеры – искусственно синтезированный однонитчатый фрагменты ДНК, которые используются для соединения фрагментов с несовместимыми концами, полученными с помощью различных рестриктаз. Для использования адаптеров необходимо знать липкие концы.
Коннекторы – используются для соединения фрагментов. К одному добавляется тимин, к др. – аденин. После объединения, в присутствии ДНК-полимераз, ДНК-лигазы возможно объединение фрагментов за счет комплементарных нуклеотидов.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему