При составлении питательных сред для глубинного культивирования продуцентов ферментов можно применять малорастворимые компоненты. Но и их количество должно быть ограниченным, так как высокое содержание нерастворимых остатков приводит к ухудшению реологических свойств среды и затрудняет последующую обработку среды и культуральной жидкости. Целесообразнее использовать в составе среды отвары и гидролизаты отходов растительного сырья (отрубей, солодовых ростков, свекловичного жома и т.д), а также грубые фильтраты спиртовой барды, гидролизаты или плазмолизаты микробной биомассы, реже – отдельные аминокислоты. Отсутствие крупной взвеси особенно важно при непрерывном процессе культивирования. Питательные среды готовят на водопроводной воде, содержание сухого вещества в них колеблется от 2,5 до 20% в зависимости от физиологических потребностей продуцента или состава целевого ферментного комплекса; рН питательных сред контролируют в момент приготовления среды, а также после ее стерилизации.
Гидролитические ферменты чаще всего имеют индуцибельную природу, и поэтому в состав среды обязательно включается вещество – индуктор, способствующее наиболее интенсивному накоплению культурой соответствующего фермента.
Источники углерода. Углерод крайне необходим микроорганизмам, так как он определяет основные метаболические пути любого организма. Источниками углерода могут быть самые различные органические соединения, они могут быть использованы в качестве скелетного материала при построении клеточного вещества и в качестве источника энергии.
При получении гидролитических ферментов, обладающих карбогидралазной активностью, источнику углерода придается особое значение, поскольку он почти всегда является стимулятором синтеза соответствующего комплекса ферментов. Если источник углерода (крахмал, пектин и др.) вводится в среду в больших количествах и она становится малоподвижная, то его следует вводить в среду постепенно по мере его потребления микроорганизмом, т. е. дробно.
Индуктором биосинтеза амилаз могут быть мальтоза, изомальтоза, паноза, нигероза, но они используются редко, так как это дорогостоящие вещества. Глюкоза как компонент среды при культивировании продуцентов карбогидраз используется очень редко, поскольку она часто является репрессором синтеза. Крахмал и продукты его гидролиза стимулируют биосинтез ксиланаз и протеиназ.
Пектинсодержащее сырье (отходы переработки плодов и овощей, яблочный и свекловичный пектины, а также гидролизаты этих отходов) являются прекрасными источниками углерода при выращивании продуцентов пектолитических и гемицеллюлазных ферментов. При этом, варьируя составом среды и концентрацией пектинсодержащего сырья, можно достигать определенного соотношения отдельных ферментов пектиназного и гемицеллюлазного комплекса. Благоприятное воздействие на биосинтетическую способность микроорганизмов оказывает лактоза, вводимая в среду в количестве 1,5-3% (введенная в виде молочной сыворотки, стимулирует биосинтез целлюлолитических ферментов, B-галактозидаз любыми продуцентами). Выбор источника углерода зависит от физиологии продуцента и вида образуемого фермента, поэтому оптимальная дозировка источника углерода выбирается индивидуально для каждого микроорганизма.
Источники азота. Источниками азота в питательной среде при глубинном культивировании могут быть минеральные соли и азот органических соединений. В процессе биосинтеза протеиназ источник азота играет роль не только необходимого компонента питания, но и активатора процесса биосинтеза. Наилучший стимулирующий эффект получается при введении в состав среды белков или продуктов их гидролиза. К органическим источникам азота относятся различные животные белки (пептон, казеин, гемоглобин, желатин, яичный альбумин), белки растительного сырья (обезжиренная соя, кукурузный экстракт), биомассы микроорганизмов, а также гидролизаты белков (кислотные, щелочные и ферментативные), отдельные аминокислоты и некоторые другие соединения.
В качестве неорганических источников азота используются различные соли азотной кислоты и аммонийные соли. При выборе источника неорганического азота следует прежде всего обращать внимание на физиологическое воздействие аниона или катиона при избирательном потреблении азота. Изменение рН среды, т. е. ее подщелачивание в случае потребления аниона или подкисление при утилизации катиона может вызвать значительные изменения в биосинтетической деятельности микроорганизма. Не меньшее значение имеет концентрация минерального источника азота (особенно на биосинтез протеиназ). Соли (NH4)2НРО4 при концентрации 0,9% более чем в 5 раз повышают биосинтетическую деятельность бактерий.
По данным многих исследователей, добавление органических источников азота во многих случаях является более эффективным, чем только неорганических, а совместное введение в среду азота солей и органических соединений может привести к их синергическому действию. А дополнительное введение в среду органического азота в виде кукурузного экстракта и пивных дрожжей способствует увеличению биосинтетической активности более чем в 12 раз. Однако единой рекомендации по составлению сред дать невозможно и необходимо экспериментальное определение состава среды для каждого продуцента.
Соотношение углерода и азота в среде имеет большое значение для биосинтеза ферментов, т. е. сбалансированность питательной среды по углероду и азоту. Дефицит одного из этих компонентов в среде не может быть компенсирован избытком другого.
Источники фосфора. Фосфор вносится в среду в виде солей фосфорной кислоты, реже – в виде органических соединений, например фитина. Фосфор может быть введен в среду с различными естественными субстратами: отварами растительных тканей, мукой, кукурузным экстрактом и т. д. Фосфор является очень важным элементом питательной среды; он входит в состав АТФ, АДФ, АМФ, которые обеспечивают энергетический обмен в клетке, а также осуществление главнейших биосинтетических процессов (синтез белков, нуклеиновых кислот, гликолиз и другие биохимические превращения). Фосфор интенсивно потребляется из среды в логарифмической фазе роста культуры, что соответствует наиболее интенсивному течению биосинтетических процессов и образованию клеточного вещества. Обычно в этот период роста в биомассу из среды переходит до 83-91% фосфора. Потребность культуры в фосфоре можно приблизительно определить путем анализа золы микробной массы продуцента.
Фосфор стимулирует биосинтез протеаз, амилаз, пектолитических ферментов. Наилучшие результаты получаются, если фосфор дополнительно вносится в виде солей фосфорной кислоты (одно- и двузамещенных солей натрия, калия и аммония) в среды, содержащие естественные растительные отвары, содержащие фосфор.
Без витаминов, ростовых веществ, ионов металлов обмен веществ в микробной клетке маловероятен. Но не все микроорганизмы требуют введения этих соединений в среду и в зависимости от этого микроорганизмы делятся на два типа: ауксоавтотрофы, не требующие введения в среду витаминов и синтезирующие их самостоятельно. Витамины не влияют на их рост и развитие. И ауксогетеротрофы, неспособные синтезировать ряд витаминов и требующие их обязательного введения в состав среды. Введение даже небольших количеств ростовых веществ заметно ускоряет их рост и развитие. К сожалению, многие продуценты являются ауксогетеротрофными и для них требуется наличие в среде комплекса витаминов группы В, т. е. биотина, инозита, пантотеновой кислоты, тиамина, пиридоксина и других, участвующих в процессах биосинтеза ферментов.
Биотин участвует в реакциях превращения аминокислот, входит в активный центр ряда ферментов, катализирующих процесс карбоксилирования и декарбоксилирования жирных кислот. Инозит, соединяясь с шестью молекулами фосфорной кислоты, образует инозитфосфорную кислоту, способствующую росту дрожжей. Пантотеновая кислота входит в состав КоА, при участии которого происходят важнейшие превращения в клетке.
Источником витаминов и ростовых веществ в питательных средах обычно являются микробные массы и различные растительные отходы, входящие в состав сред. Наиболее богатыми источниками этих соединений являются автолизаты микробных масс, в настоящее время для этих целей часто используют кормовые дрожжи, плазмолизированные или подвегнутые кислотному или ферментативному гидролизу. Богаты витаминами и ростовыми веществами кукурузный экстракт, спиртовая барда, отвары муки, выжимки плодов и овощей. Но так как эти компоненты среды служат одновременно источниками углерода, азота, фосфора и их количество в среде чаще всего определяется именно этими элементами, содержание витаминов и ростовых веществ в средах бывает достаточным и не требуется их дополнительного введения. Если же среда для культивирования используется синтетическая, то возникает необходимость специального исследования по выявлению потребности продуцента в этих соединениях.
Макро- и микроэлементы являются неотъемлемой частью состава питательных сред. Многие ионы металлов входят в активный центр ферментов или участвуют в поддержании пространственной структуры ферментов и обеспечивают энзиматическую деятельность организма, обмен веществ в нем. Более четверти известных в настоящее время ферментов относятся к металлоферментам. Они активируют процессы дыхания, окислительно-восстановительные реакции, синтез аминокислот, жирных кислот, сахаров, нуклеотидов, пиримидиновых оснований, регулируют образование биполярных молекул белков, гликогена, нуклеиновых кислот, их трансформацию и распад.
Все металлоферменты делятся на две группы. К первой относятся истинные металлоферменты с прочной связью между ионами металла и белковой частью, не разрушаемой при пропускании через иониты. Вторая группа характеризуется тем, что ион металла легко отщепляется при диализе или при другой обработке раствора от белковой части фермента с потерей каталитических свойств. При добавлении металла ферменты данной группы вновь активируются.
В окислительно-восстановительных процессах участвуют ферменты, требующие присутствия железа, меди, марганца, цинка, бора и молибдена. Активность дыхания и интенсивность расщепления органических субстратов зависят от специфической активации ферментов тем или другим металлом. Таким образом, металлы и их комплексные соединения являются не случайными примесями, а биологически важными компонентами. Микроэлементы могут регулировать обменные процессы в организме и изменять направление ферментативных реакций. Синтез аминокислот катализируют ферменты, на которые влияют марганец, молибден, железо, кобальт; белки синтезируются при участии молибдена, цинка, меди, бора; на синтез липидов влияет наличие бора, меди, марганца, кобальта.
Зависимость потребности в микроэлементах от скорости роста микроорганизмов и от образования ими ферментов установить трудно, так как количества микроэлементов, в которых нуждаются микроорганизмы, очень малы. О потребности в микроэлементах для биосинтеза клеточного вещества судят на основании анализа состава золы биомассы микроорганизма.
Присутствие или отсутствие отдельных микроэлементов может оказывать стимулирующее действие на накопление в среде определенных ферментов. Например, снижение содержания меди и цинка в среде приводит к интенсификации биосинтеза амилолитических ферментов. Биосинтез амилаз стимулируется ионами натрия, кобальта, кальция и магния, но тормозится в присутствии ионов марганца, меди и ртути. Большое значение для образования протеиназ имеют кобальт, медь, молибден, марганец, цинк и некоторые другие микроэлементы. Одним из важнейших микроэлементов, влияющих на синтез протеолитических ферментов, является цинк. Он стимулирует образование протеиназ микроскопическими грибами, бактериями и актиномицетами. Возможно, это связано с интенсификацией углеводного обмена и синтеза аминокислот и белков. Предполагают также, что цинк входит в состав ряда протеиназ.
Потребность микроорганизмов в макроэлементах обычно компенсируется введением соответствующих солей, а микроэлементы вносятся в необходимом количестве с водопроводной водой, реактивами и растительными отварами.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему