Гемоглоби́н (от др.-греч. αἷμα— кровь и лат. globus — шар) — сложный железосодержащий белок кровосодержащих животных, способный обратимо связываться с кислородом, обеспечивая его перенос в ткани. У позвоночных животных содержится в эритроцитах, у большинства беспозвоночных растворён в плазме крови (эритрокруорин) и может присутствовать в других тканях.
Главная функция гемоглобина состоит в переносе кислорода. У человека в капиллярах лёгких в условиях избытка кислорода последний соединяется с гемоглобином. Током крови эритроциты, содержащие молекулы гемоглобина со связанным кислородом, доставляются к органам и тканям, где кислорода мало; здесь необходимый для протекания окислительных процессов кислород освобождается из связи с гемоглобином. Кроме того, гемоглобин способен связывать в тканях небольшое количество диоксида углерода (CO2) и освобождать его в лёгких. Монооксид углерода (CO) связывается с гемоглобином крови намного сильнее( почти в 500 раз), чем кислород, образуя карбоксигемоглобин (HbCO). Некоторые процессы приводят к окислению иона железа в геме до степени окисления +3. В результате образуется форма гемоглобина, известная как метгемоглобин (HbOH) (metHb, от мета… и гемоглобин, иначе гемиглобин или ферригемоглобин, см. Метгемоглобинемия). В обоих случаях блокируются процессы транспортировки кислорода. Впрочем, монооксид углерода может быть частично вытеснен из гема при повышении парциального давления кислорода в легких.
Нормальным содержанием гемоглобина в крови человека считается: у мужчин 130—170 г/л (нижний предел — 120, верхний предел — 180 г/л), у женщин 120—150 г/л; у детей нормальный уровень гемоглобина зависит от возраста и подвержен значительным колебаниям. Так, у детей через 1—3 дня после рождения нормальный уровень гемоглобина максимальный и составляет 145—225 г/л, а к 3—6 месяцам снижается до минимального уровня 95—135 г/л, затем с 1 года до 18 лет отмечается постепенное увеличение нормального уровня гемоглобина в крови.
Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гему различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора.
Из “старых” методов, все еще применяемых в ряде лабораторий, остановимся на следующих: сапониновом и методе Сали.
При использовании сапонинового метода тельца Гейнца не растворяются, раствор остается мутноватым, за счет чего может меняться спектр поглощения раствора, и ошибка при этом достигает 20-30%.
В методе Сали измеряется гематин, образовавшийся при взаимодействии гемоглобина с соляной кислотой. Метод основан на визуальной оценке содержания гемоглобина путем сравнения окраски исследуемой пробы со стандартными растворами солянокислого гематина. Ошибка метода достигает ~ 30%, на результаты определения влияют многие факторы: время реакции между гемоглобином и соляной кислотой, которое может колебаться от 2 до 40 мин в зависимости от содержания белков крови; оттенок цвета геминхлорида, зависящий от содержания билирубина в крови; характера освещения и пр.
Химические и спектрофотометрические методы имеют высокую точность и рекомендуются в качестве референсных, но из-за трудоемкости и значительной стоимости анализа для рутинных определений не применяются.
Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь человека - это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа. Однако, некоторые данные не позволяют использовать гемиглобиназидный метод в качестве альтернативного в силу следующих причин: конечный продукт превращения гемоглобина - HbN3 имеет слабый пик поглощения при l = 540 нм, что не дает возможности использовать фотометры с широкополосными фильтрами; иногда возникают проблемы, связанные с мутностью растворов; и наконец, раствор HbN3 не хранится при комнатной температуре. Напротив, гемиглобинцианидный и гемихромный методы лишены этих недостатков и при дальнейших исследованиях им было отдано предпочтение.
Интерференция при всех колориметрических методах анализа
Повышение гемоглобина: гипертриглицеридемия, количество лейкоцитов более 25х109/л, прогрессирующие заболевания печени, наличие легко преципитирующихся глобулинов (при миеломной болезни или при макроглобулинемии Вальденстрема).
- Понижение гемоглобина: у заядлых курильщиков вследствие образования неактивного HbСО.
Гемиглобинцианидный метод
Принцин гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну - гемиглобинцианид. Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.
Характеристика метода
Гемиглобинцианидный метод, разработанный в 1936 г Драбкиным, был одобрен Международным Комитетом по стандартизации в гематологии (ICSH) в 1963 г.
Экспериментальное изучение данного метода для его стандартизации в гемиглобинометрии имело следующие главные цели: найти точное значение коэффициента молярной экстинкции для HbCN при l = 540 нм; разработать требования для получения калибровочного раствора HbCN, обеспечивающие его стабильность в течение нескольких лет; усовершенствовать процедуру анализа при определении гемоглобина для снижения экспериментальных ошибок; оценить надежность других методов в сравнении с гемиглобинцианидным. На основе широкомасштабных исследований был определен коэффициент молярной экстинкции гемиглобинцианида, равный 11,00 (e540 = 11,00), и выработаны требования к его качеству.
Основные достоинства гемиглобинцианидного метода:
- HbCN является стабильным производным гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbCN;
- спектр поглощения HbCN имеет плоский максимум при l = 540 нм, поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;
- растворы HbCN строго подчинены закону Ламберта-Бера при l = 540 в широком диапазоне концентраций;
- калибровочный раствор HbCN устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему