В 1972 г. П.Берг с сотрудниками впервые сообщили о получении in vitro гибридной молекулы, состоящей из ДНК вируса SV40 и ДНК фага λdvgal. При этом использовался метод, получивший название коннекторного. Принцип одного из вариантов этого метода заключается в следующем. К 3’-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достраивают одноцепочечные олиго(dА)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента – олиго(dТ)-сегменты примерно такой же длины. При смешении полученных таким образом фрагментов формируются кольцевые структуры за счет водородных связей между олиго(dА)- и олиго(dТ)-последовательностями. Одноцепочечные бреши гибридных молекул ДНК застраивают с помощью ДНК-полимеразы I Е. coli и цепи ковалентно сшивают в лигазной реакции.
Коннекторным методом удается рекомбинировать in vitro фрагменты ДНК, полученные любым из способов расщепления исходной ДНК (механическим, ферментативным). При этом используют синтетические комплементарные олиго(dA)·олиго(dT)- или олиго(dG)·олиго(dС)-концы. Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно используют коннекторный метод.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему