Нужна помощь в написании работы?

Более простой и самый популярный метод получения in vitro гибридных молекул ДНК – рестриктазно-лигазный. Первые гибридные молекулы ДНК получили этим методом С.Коэн с сотрудниками в 1973 г.

Данный метод состоит в следующем:

1. рестриктазой класса II специфически разрезают молекулы ДНК на фрагменты, имеющие идентичные взаимокомплементарные липкие концы;

2. препараты различных молекул ДНК, гидролизованных одной и той же рестриктазой, смешивают, и при определённых условиях липкие концы разных фрагментов ДНК реассоциируют за счёт комплементарного взаимодействия;

3. с помощью ДНК-лигазы происходит ковалентное связывание ассоциированных фрагментов ДНК.

По такой схеме могут быть ковалентно соединены in vitro два и более любых фрагмента, полученных при гидролизе молекул ДНК одной и той же рестриктазой. Однако с помощью рестриктаз (особенно одного фермента) в каждом конкретном случае можно получить лишь специфический, строго определенный набор фрагментов изучаемой ДНК. Первоначально это в некоторой степени ограничивало применение рестриктазно-лигазного метода. Но затем получила распространение новая его модификация, основанная на использовании линкерных молекул – синтетических сегментов ДНК, содержащих в своём составе последовательности, узнаваемые рестриктазами. Метод предложили Р.Шеллер с сотрудниками в 1977 г. Он позволяет достаточно просто рекомбинировать in vitro практически любые фрагменты ДНК.

Разработанный подход включает следующие операции:

1. по тупым или липким концам фрагмента ДНК, который предполагается рекомбинировать, с помощью лигазы фага Т4 пришивают короткие синтетические двухцепочечные сегменты, имеющие участки узнавания определенной рестриктазы;

2. полученный фрагмент обрабатывают выбранной рестриктазой, в результате чего образуются липкие концы;

3. полученный фрагмент рекомбинируют in vitro с другими молекулами ДНК по обычной схеме рестриктазно-лигазного метода.

Использование линкерных молекул делает рестриктазно-лигазный метод рекомбинации фрагментов ДНК in vitro универсальным, поскольку исходные фрагменты можно получать самыми различными способами.

Рестриктазно-лигазный метод, по сравнению с коннекторным методом, находит более широкое применение в генно-инженерных манипуляциях, поскольку он более прост биохимически и, кроме того, даёт возможность легко выщепить встроенный фрагмент из гибридной молекулы ДНК, что часто бывает важно при переносе фрагмента в другое генетическое окружение.

Поделись с друзьями