Важной задачей генетической инженерии являлась разработка методов расшифровки нуклеотидной последовательности, их также называют методами секвенирования. В середине 70-х годов появились два таких метода. Один основывался на химической модификации оснований непосредственно на анализируемой ДНК, метод Максама-Гилберта. Другой метод – метод Сэнгера, позволял определить последовательность благодаря анализу одноцепочечных копий ДНК, полученых путём полимеразного копирования. Но оба метода имеют общие черты: секвенирование ведут на одноцепочечных копиях ДНК, а разделение фрагментов ДНК по их длинам ведут методом электрофореза.
Электрофорез ДНК – это метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через полиакриламидный гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода к аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.
Химический метод Максама-Гилберта (рис. 4) основан на реакциях, которые специфически модифицируют азотистые основания. Сначала 5’-конец анализируемого фрагмента ДНК метят радиоактивным фосфором. Затем модифицируют определённые азотистые основания, а после специфической обработки они отщепляются от цепи, нуклеотидная цепь рвётся в местах, где нет оснований, причём модификация основания и последующий разрыв цепи должен происходить в определённом нуклеотиде. Далее получившиеся фрагменты ДНК подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле на параллельных дорожках, положение электрофоретических зон фиксируют на рентгеновсой плёнке. С помощью помеченного радиоактивным фосфором 5’-конца можно определить начало фрагмента с последующим анализом нуклеотидов фрагмента по электрофорерограмме (рис. 5).
Метод полимеразного копирования Сэнгера. Анализируемые фрагменты клонируют в векторах на базе фага, либо с помощью ДНК-полимеразы I. Дальнейшие реакции синтеза проводят в четырёх пробирках, где находятся фрагменты ДНК, дезоксинуклеозидтрифосфаты четырёх типов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) один из которых мечен радиоактивным фосфором и 2’,3’-дидезоксинуклеозидтрифосфат одного типа (например ddATP). Последний аналог включаясь в цепь не даёт расти цепи дальше, поскольку он не имеет на 2’- и 3’-конце гидроксильной группы (рис. 6). Получившиеся фрагменты анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле. Положение электрофоретических зон, фиксируемое на авторадиограммах, указывает на последовательность нуклеозидмонофосфатных остатков в анализируемом фрагменте ДНК.
С помощью этих методов возможна расшифровка последовательности в 200-500 пн. Это не так уж и много, ведь размеры ДНК вирусов и прокариот намного больше. Требовалось разработать методы автоматического секвенирования. Первый автоматический ДНК-секвенатор был разработан в США в 1987 г. В основе метода остался принцип анализа ДНК по электрофорерограмме, но для того, чтобы пометить цепи использовали молекулы флуоресцирующего соединения. Серьезное значение в автоматическом секвенировании ДНК приобретает точность определения нуклеотидной последовательности, поскольку в большинстве случаев экспериментатор не участвует в процессе её чтения и занесения в компьютер. Современные автоматические секвенаторы несравнимо превосходят человека по производительности, более того, каждый год такие автоматы удается улучшать. Всё это ведёт к тому, что секвенирование фрагментов ДНК становится простой процедурой, доступной в любой молекулярно-биологической лаборатории.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему
Реферат
Расшифровка нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК. Методы секвенирования
От 250 руб
Контрольная работа
Расшифровка нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК. Методы секвенирования
От 250 руб
Курсовая работа
Расшифровка нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК. Методы секвенирования
От 700 руб