Нужна помощь в написании работы?

Важной задачей генетической инженерии являлась разработка методов расшифровки нуклеотидной последовательности, их также называют методами секвенирования. В середине 70-х годов появились два таких метода. Один основывался на химической модификации оснований непосредственно на анализируемой ДНК, метод Максама-Гилберта. Другой метод – метод Сэнгера, позволял определить последовательность благодаря анализу одноцепочечных копий ДНК, полученых путём полимеразного копирования. Но оба метода имеют общие черты: секвенирование ведут на одноцепочечных копиях ДНК, а разделение фрагментов ДНК по их длинам ведут методом электрофореза.

Электрофорез ДНК – это метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через полиакриламидный гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода к аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.

Химический метод Максама-Гилберта (рис. 4) основан на реакциях, которые специфически модифицируют азотистые основания. Сначала 5’-конец анализируемого фрагмента ДНК метят радиоактивным фосфором. Затем модифицируют определённые азотистые основания, а после специфической обработки они отщепляются от цепи, нуклеотидная цепь рвётся в местах, где нет оснований, причём модификация основания и последующий разрыв цепи должен происходить в определённом нуклеотиде. Далее получившиеся фрагменты ДНК подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле на параллельных дорожках, положение электрофоретических зон фиксируют на рентгеновсой плёнке. С помощью помеченного радиоактивным фосфором 5’-конца можно определить начало фрагмента с последующим анализом нуклеотидов фрагмента по электрофорерограмме (рис. 5).

Метод полимеразного копирования Сэнгера. Анализируемые фрагменты клонируют в векторах на базе фага, либо с помощью ДНК-полимеразы I. Дальнейшие реакции синтеза проводят в четырёх пробирках, где находятся фрагменты ДНК, дезоксинуклеозидтрифосфаты четырёх типов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) один из которых мечен радиоактивным фосфором и 2’,3’-дидезоксинуклеозидтрифосфат одного типа (например ddATP). Последний аналог включаясь в цепь не даёт расти цепи дальше, поскольку он не имеет на 2’- и 3’-конце гидроксильной группы (рис. 6). Получившиеся фрагменты анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле. Положение электрофоретических зон, фиксируемое на авторадиограммах, указывает на последовательность нуклеозидмонофосфатных остатков в анализируемом фрагменте ДНК.

С помощью этих методов возможна расшифровка последовательности в 200-500 пн. Это не так уж и много, ведь размеры ДНК вирусов и прокариот намного больше. Требовалось разработать методы автоматического секвенирования. Первый автоматический ДНК-секвенатор был разработан в США в 1987 г. В основе метода остался принцип анализа ДНК по электрофорерограмме, но для того, чтобы пометить цепи использовали молекулы флуоресцирующего соединения. Серьезное значение в автоматическом секвенировании ДНК приобретает точность определения нуклеотидной последовательности, поскольку в большинстве случаев экспериментатор не участвует в процессе её чтения и занесения в компьютер. Современные автоматические секвенаторы несравнимо превосходят человека по производительности, более того, каждый год такие автоматы удается улучшать. Всё это ведёт к тому, что секвенирование фрагментов ДНК становится простой процедурой, доступной в любой молекулярно-биологической лаборатории.

Поделись с друзьями