Назначение и главнейшие типы векторов

Предпосылки использования векторов в генной инженерии и биотехнологии.

(1) открытие нуклеиновых кислот и генетического кода

(2) открытие внехромосомных элементов у про- и эукариот – плазмид

(3) открытие вирусов и особенно механизмов встраивания вирусной ДНК в геном хозяина

(4) разработка методов выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных плазмид и неповрежденной ДНК вирусов

(5) раскрытие механизмов проникновения чужеродной ДНК в клетки

(6) открытие ферментов, обеспечивающих репликацию и модификацию ДНК (резку, гидролиз, сшивку)

Назначение векторов. В фундаментальной науке векторы служат для изучения отдельных генов и целых геномов путем их клонирования и последующего сиквенса, для изучения функций генов и молекулярных механизмов их экспрессии.

В инженерии векторы служат для создания генно-модифицированных организмов-продуцентов.

Клонирование как способ исследования структурной организации генетических элементов и систем экспрессии. (1) прежде всего, клонирование целевых фрагментов в клетках бактерий позволило в свое время изучить (расшифровать) структуру многих генов путем технологий чтения (сиквенса); клонирование служило для амплификации фрагмента, подвергающегося затем секвенирующим реакциям; (2) исследование функций генов путем их инактивации. Такое применение молекулярные векторы получили при исследовании генома млекопитающих. Детерминируемые каким-либо геном свойства на уровне фенотипа изучают, «выключая» данный ген, но при этом инактивированный ген должен быть в гомозиготном состоянии.

В качестве векторов в генной инженерии и биотехнологии применяют два главнейших класса молекулярных объектов: (1) плазмиды и их производные, (2) вирусы, либо вирусную ДНК (во втором случае вирусы без белкового компонента – капсида).

Плазмиды и их производные. Plasmid is a DNA molecule that is separate from, and can replicate independently of, the chromosomal DNA. They are double-stranded and, in many cases, circular. Plasmids usually occur naturally in bacteria, but are sometimes found in eukaryotic organisms (e.g., the 2-micrometre ring in Saccharomyces cerevisiae). Plasmid sizes vary from 1 to over 1,000 kbp. (2-более 300 тпн). The number of identical plasmids in a single cell can range anywhere from one to thousands under some circumstances. Plasmids can be considered part of the mobilome because they are often associated with conjugation, a mechanism of horizontal gene transfer. There are two types of plasmid integration into a host bacteria: non-integrating plasmids replicate as with the top instance, whereas episomes, the lower example, integrate into the host chromosome.

Производными плазмид могут быть космиды ― гибриды бактериофага и плазмиды и искусственные бактериальные хромосомы (BAC). Космиды. A cosmid, first described by Collins and Hohn in 1978, is a type of hybrid plasmid (often used as a cloning vector) that contains a Lambda phage cos sequence. Cos sequences are ~200 base pairs long and essential for packaging. They contain a cosN site where DNA is nicked at each strand, 12bp apart, by terminase. This causes linearization of the circular cosmid with two "cohesive" or "sticky ends" of 12bp. (The DNA must be linear to fit into a phage head.) The cosB site holds the terminase while it is nicking and separating the strands. The cosQ site of next cosmid (as rolling circle replication often results in linear concatemers) is held by the terminase after the previous cosmid has been packaged, to prevent degradation by cellular DNases. Cosmids' (cos sites + plasmid = cosmid) DNA sequences are originally from the lambda phage. Cosmids can be used to build genomic libraries. Cosmids are able to contain 37 to 52 kb of DNA, while normal plasmids are able to carry only 1–20 kb.

Вирусы. A virus is a small infectious agent that can replicate only inside the living cells of an organism. Delivery of genes by a virus is termed transduction and the infected cells are described as transduced. There are millions of different types of viruses, although only about 5,000 of them have been described in detail. Размер ДНК: для фага лямбда – 48,5 тпн.