ДНК-лигаза - Молекулярные вектора (векторные системы). Лекции.

Лигазы были открыты в связи с изучением процесса кроссинговера (рекомбинации), первоначально на примере ДНК бактериофагов. Лигаза катализирует синтез фосфодиэфирной связи и воссоединяет расщепленные нуклеазами молекулы ДНК. Лингаза способна соединять как ликие, так и тупые концы, во всех случаях, где есть возможность состыковки 5´-р и 3´-OH концов. Лигирование одноцепочечных концов возможно при их полной комплиментарности.  Успех образования кольцевых молекул ДНК под действием лигазы определяется концентрацией самой ДНК: при высокой концентрации идет сшивка в длинные линейные молекулы, при низкой – преимущественно в кольцевые.

ДНК-полимераза I E.coli (polI)

– фермент, непосредственно производящий клонирование целевой ДНК в составе векторов. Это первые фермент-полимераза, который был открыт в 1958 г. Фермент имеет 3-доменную структуру, каждый домен катализирует свою функцию:

{{5´-3´-полимераза + 3´-5´-экзонуклеаза} = Фрагмент Кленова} + 5´-3´- экзонуклеаза

ДНК-полимераза связывается с одноцепочечными кольцевыми молекулами ДНК. Для 5´-3´-полимераз ной активности, т.е. синтеза комплиментарной цепи от 5' к 3’ концу, необходимо наличие праймера, или затравки. 3´-5´-экзонуклеазная активность – это гидролиз (разложение на нуклеотиды) одноцепочечных выступающих концов:

5’…pC-pG-pC-pA-pT-pG-pT-OH

3’…Gp-Cp-Gp

                                          ↓     polI + Mg2+

5’…pC-pG-pC-OH     +   pA, pT, pG

3’…Gp-Cp-Gp

5´-3´- экзонуклеазная активность: деградирует одну цепь 2-цепочечной ДНК, начиная со свободного 5'-конца, создавая одноцепочечный выступающий 3'-конец.

Таким образом, полимераза не только реплицирует ДНК, но производит репарации ее повреждений.

Обратная транскриптаза (ревертаза) – синтезирует на РНК-матрице комплиментарную ДНК.  Открыта у ретровирусов (содержат одноцепочечную РНК) геном которых проходит фазу интеграции в геном хозяина в виде двухцепочечной ДНК.

Нуклеаза Bal31 – уникальный фермент, который одновременно способен работать как экзонуклеаза, удаляя малое количество нуклеотидов и с 5'- и с 3'-концов двухцепочечной ДНК, и как эндонуклеаза, расщепляет одноцепочечную ДНК.

Терминальная трансфераза – катализирует последовательное присоединение дезоксинуклеотидов к 3'-OH концу ДНК: как одноцепочечной, так и 2-цепочечной с выступающим 3'-концом.

Поли(А)-полимераза – катализирует присоединение к свободному 3'-OH концу одноцепоч. РНК поли(А)-последовательности. Используется для подготовки молекул РНК к получению с них кДНК.