Одним из исходных научных положений метода, позволившего осуществлять различные действия с генами, является открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты способны распознавать определенную последовательность
«своей» ДНК и расщеплять «чужую» ДНК на мелкие фрагменты. В настоящее время выделены рестриктазы, распознающие более 150 мест расщепления ДНК.
Установлено, что рекриктазы могут быть мелко- и крупнорасщепляющими. Первые узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы больше разрывов, чем вторые, узнающие последовательность из 6 нуклеотидных пар. Следует отметить, что рестриктазы по-разному расщепляют ДНК – одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, другие – со сдвигом с образованием «ступеньки». В первом случае образуются так называемые «тупые» концы, а во втором – «липкие» концы, т.е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные (комплементарность в биохимии – взаимное соответствие в химическом строении двух макромолекул, обеспечивающее их взаимодействие – спаривание двух нитей ДНК, соединение фермента с субстратом, антигена с антителом; комплементарные структуры подходят друг к другу как ключ к замку) участки длиной в 4 нуклеотида. Такие фрагменты удобны для создания рекомбинантных ДНК (рекомбинантные ДНК – это ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников).
Сшивка фрагментов ДНК, полученных при помощи рестриктаз, производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК:
– сшивка по одноименным «липким» концам – любые два фрагмента ДНК, независимо от их происхождения, образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов;
– сшивка по «тупым» концам – менее эффективный метод, поэтому для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются «липкими» концами;
– сшивка фрагментов с разноименными «липкими» концами – для связи разноименных, то есть некомплементарных друг другу «липких» концов, используют так называемые линкеры или «переходники» (линкеры – это химически синтезированные олигонуклеотиды, представ-ляющие собой сайты (англ. site – место), рестрикции (места расщепления) или их комбинацию; существуют большие наборы линкеров, в том числе «тупой конец – липкий конец»). После того как ДНК сшита в пробирке, ее надо ввести в живые клетки и обеспечить стабильное поддержание генетической информации, что достигается с помощью, так называемых, векторных молекул.
Векторными молекулами, или векторами, называют молекулы ДНК, способные акцептировать (от лат. acceptus – принятый) чужеродную ДНК и обеспечивать ее репликацию (от позднелат. replicatio – повторение, удвоение молекул ДНК (у некоторых вирусов РНК) при участии специальных ферментов; репликацией называется также удвоение хромосом, в основе которого лежит репликация ДНК; репликация обеспечивает точное копирование генетической информации, заключенной в молекулах ДНК, и передачу ее от поколения к поколению), возможно, и экспрессию (экспрессия гена – проявление генетической информации, записанной в гене, в форме рибонуклеиновой кислоты, белка и фенотипического признака). Векторы позволяют осуществить введение в клетку дополнительной генетической информации. В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги, вирусы животных.
К векторной молекуле предъявляются следующие требования:
– она должна иметь область, чувствительную к определенной рестриктазе, которая, расщепляя вектор в одном участке, превращает его кольцевую форму в линейную; к линейной ДНК «пришивают» ген или гены и затем снова замыкают ее в кольцо, а рекомбинантную ДНК вводят в живые клетки;
– вектор должен реплицироваться в определенных клетках;
– в составе векторной молекулы должен быть маркерный (от франц. marquer - отмечать) ген, который после проникновения вектора в клетку придает ей фенотип (в биологии – совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития), свидетельствующий о присутствии вектора. В качестве маркерного гена, как правило, используют гены устойчивые к антибиотикам, чаще всего устойчивые к ампициллину. При создании трансгенных растений применяют природный генный вектор, возникший в организме почвенных бактерий (Agro-bacteria).
В генной инженерии используют в основном почвенные бактерии Agrobacterium tumefacies и Agrobacterium rhizogenes. В зависимости от типа плазмиды Ti (в случае A. tumefaciens) либо Ri (в случае А. rhizogenes), попав в организм растения, они начинают экспрессировать чужеродные гены (онкогены), что приводит к образованию опухолей. Ученые научились «обезоруживать» Ti- и Ri- плазмиды, заменяя онкогены в переносимой части плазмид (так называемая Т-ДНК) на те гены, которые необходимо ввести в растение. Один из способов введения чужеродной ДНК заключается в использовании промежуточного вектора.
Сущность этого способа состоит в том, что Т-ДНК с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды и вставляют в вектор для клонирования в Е. cоli например pBR 322. Плазмиду с Т-ДНК размножают и, используя стандартные методы, встраивают чужеродный ген внутрь Т-области и вновь размножают с уже вставленным геном. Затем полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefacience, несущую полную Ti-плазмиду.
В результате двойной рекомбинации между гомологичными (от греч. homologos – соответственный, подобный), областями Т-ДНК часть рекомбинантной плазмиды, которая содержит чужеродный ген, включится в Ti -плазмиду, заместив в ней нормальную Т-ДНК. Бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенными генами, заражают растения, в результате чего образуются опухоли – корончатый галл. Начинается перестройка метаболизма клеток, которые будут содержать Ti-область со встроенным в него чужеродным геном.
Существуют и другие методы введения чужеродной генетической информации: применение бинарных векторов; векторов на основе ДНК-содержащих вирусов растений; прямого переноса генов. Метод биологической баллистики является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации однодольных.
Сущность этого метода заключается в том, что на мельчайшие частицы золота или вольфрама, диаметром 0,6–1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые или золотые частицы, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помешаются внутрь биологической баллистической (биолистической) пушки. Они с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. С помощью биолистической пушки были протрансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом были получены стабильные растения трансформанты.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему