Ретровирусные векторы также используются для получения трансгенных животных. Инфицирование предимплантационных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами - относительно несложная эффективная процедура. Восьмиклеточную морулу (рис. 1. 2.1) освобождают от яйцевой оболочки и помещают в культуральную чашку с фибробластами, продуцирующими рекомбинантный ретровирус. Инфицированные эмбрионы, достигшие стадии бластулы, имплантируют псевдобеременным самкам. В результате формируются трансгенные организмы, мозаичные по числу и локализации встроек рекомбинантной ДНК в геном. Поэтому для получения чистых линий далее необходим масштабный аутбридинг.
Рис. 1.2.1. Схема получения линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов
Недостатком метода является ограничение вставки экзогенной ДНК ~8 тнп, вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии, а в некоторых случаях интеграция в исходный локус нестабильна.
Новые лентивирусные векторы (лентивирусы принадлежат семейству ретровирусов) показали свою очень высокую эффективность при доставке ДНК в ооциты и зиготы. Инъекция рекомбинантных лентивирусных конструкций в перивителлиновое пространство свиных зигот и коровьих ооцитов привело к появлению потомства с самой высокой на данный момент долей трансгенных особей. В то же время лентивирусные векторы обладают всеми недостатками ретровирусных: малый размер вставки экзогенной ДНК и множественная интеграция в хозяйский геном, которая может привести к таким нежелательным побочными эффектам, как активация онкогенов и инсерционный мутагенез. Кроме того, для лентивирусных векторов наблюдается высокая степень мозаичности получаемого трансгенного потомства и отдельные факты сайленсинга (инактивации) лентивирусных рекомбинантных последовательностей в полученных трансгенных линиях.
Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой не-достаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы - помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность .
Поможем написать любую работу на аналогичную тему