Идентификация бактерий. Морфологические, тинкториальные, культуральные, физиолого-биохимические, серологические признаки.

Основана на функциональных признаках (физиология и генетика), тк по большому счету, клетки мало чем различаются.

Морфологические признаки. Форма, размер, подвижность, наличие жгутиков, спорообразование, наличие везикул и включений. Наличие клеточной стенки и ее строение – окраска по граму.

Тинкториальные признаки. Способность бактерий и грибов вступать в р-цию с красителями и окрашиваться определенным образом.

Культуральные признаки. Характерные особенности бактерий на плотных и жидких средах. Обычно исп для характеристик, для идентификации редко.

Физиолого-биохимические признаки. Установление способа питания, тип энергетического метаболизма. Отношение к О2, Т, рН, солености, освещенности и др факторам. Тип субстрата, потребность в витаминах, специфические метаболиты и Е.

Серологические признаки. Связывание антител с антигеном бактерии. Очень точный, различает близкородственные штаммы, но только для патогенов или симбионтов.

Систематика на основе генетического родства. Построение филогенетической системы, кот определяется содержанием ГЦ в ДНК, ДНК-ДНК и ДНК-рРНК гибридизацией и на основе нукл состава рРНК 5, 16 и 23.
содержание ГЦ колеблется от 25 до 75% и видоспецифично. Но одинаковое соотношение ГЦ еще не обозначает родственность между штаммами – может быть разное распределение этих пар.
близость ДНК состава уже указывает на родство. Расхождение более 15% - разные виды. Если в результ эволюционной дивергенции ДНК отличаются сильно, то лучше использовать ДНК-рРНК, выявляет довольно высокую гомологию.
ДНК-зонды – разновидность ДНК-ДНК гибридизации. Гибридизация ДНК бактеии с отрезком ДНК (зондом), содержащим маркер – напр ген устойчивости к АБ или пигмент. Создают путем молекулярного клонирования. Берется ДНК второй бактерии, режется рестриктазами, все отрезки секвенируются и записываются в банк генов. Проводится ПЦР, нужный ген ищется форезом, потом выделяется, метится радиометкой и вставляется в плазмиду. Плазмида внедряется в модельную культуру – кишечка или бациллюс, и наращивается биомасса. ДНК модельной бактерии выделяется и производится гибридизация ДНК с исследуемой культрурой. Методом авторадиографии ищется радиометка в ДНК. Анализируется степень гибридизации.

16SрРНК систематика. рРНК осдержат участки наиболее высокой генетической стабильности. 1500 пн. Режут эндонуклеазами и секвенируют. Именно этим способом выделили архебактерии.

Хемотаксономические признаки идентификации. Используется для групп, у кот морфологические и физиологические хар-ки сильно варьируют. Анализ по гетерополимерам кл стенки, липидный и жирнокислотный состав.  Но содержание жирных кислот иногда зависит от условий культивирования. Состав хинонов, переносчиков, пигментов. Изучение белков (белковая таксономия) белки рибосом наиболее консервативны. Мембранные белки отражают внутривидовые различия.

Идентификация некультивируемых. Некультивируемые виды – те, кто не растет на средах в лаборатории. Идентификация возможна только по ДНК. подходы, основанные на извлечении из образцов окружающей среды именно нуклеиновых кислот, изучение которых и становится основным методом исследования структуры микробных сообществ.

Проблема здесь заключается в том, что большая часть микроорганизмов из природных образцов при попытках пересева на синтетические питательные среды переходит в так называемое "некультивируемое" состояние. Это обстоятельство приводит к тому, что при извлечении микроорганизмов из образцов окружающей среды мы никогда не можем быть уверены в представительности получаемой выборки. Критерии такой представительности не ясны, так что мы на самом деле никогда не знаем, насколько полна картина структуры сообщества, которую нам удается выявить в последующих экспериментах.

Прямая экстракция ДНК из почв, как показали исследования авторов, применима к различным почвам и дает выход ДНК чаще всего в диапазоне от 10 до 30 мкг/на г почвы. Следует, однако, иметь в виду, что выход колеблется в зависимости от состава почвы, так что необходимо подбирать условия эксперимента для данной конкретной почвы. В отдельных случаях отмечен на порядок меньший выход ДНК, хотя в этих случаях отмечено и более низкое содержание колониеобразующих единиц микрофлоры.  Непрямая экстракция ДНК с предварительным извлечением клеток весьма существенно зависит от способа экстракции микробных клеток из почвы.

Этой же группой исследователей подробно описана процедура экстракции рРНК и геномной ДНК из образцов почвы. Сущность процедуры сводится к отделению клеток от частиц почвы с последующим разрушением клеток путем обработки шариками, детергентом, экстракцией фенолом, фенол-хлороформ-ной смесью и далее - стандартными приемами очистки нуклеиновых кислот и разделения на фракции РНК и ДНК. Выход ДНК и рРНК составлял 15-30 и 0,25-1,0 мкг/г почвы соответственно.

В случае водных микроорганизмов проблема выделения нуклеиновых кислот решается проще: клетки выделяют фильтрованием и затем лизируют либо непосредственно на фильтре и проводят ПЦР также на фильтре, либо подвергают клетки ферментативному лизису с последующей экстракцией ДНК фенолом и хлороформом. ДНК анализируется каким0нибудь методом из вышеперечисленных. Такие микроорганизмы даже описывают, но с припиской кандидат. Эта подпись будет сопровождать вид до тех пор, пока не будут найдены условия для культивирования.