Микроскопические методы изучения микроорганизмов. Световой микроскоп. Фазово-контрастная, люминесцентная микроскопия.

Световая микроскопия основана на законах оптики и волновой теории образования изображения

факторы  - разрешающая способность, характер и направленность светового луча, особенности изучаемого объекта. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света - цвет, якость, фаза, плотность. Изменение данной длинны волны может быть использовано для изучения только таких структур, минимальные размеры которых сопоставимы с длинной волны самого излучения. (0,4 ф - 0.7 к)

Апертура - способность собирать свет и противостоять дифракционному разложению деталей изображения. Числовая апертура объективов, граничащих с воздухом не может быть больше 1. Т.к. показатель преломления воздуха = 1. Для увеличения разрешающей способности на препарат помещают иммерсионное масло (часто кедровое) т.к. его показатель преломления 1,51 (у стекла 1,52) => проходя через эти среды луч не сильно отклоняется от оси.

Апертурная диафрагма - ограничивает диаметр световых пучков. Разрешение прямо пропорционально апертуре. Чем выше аппертура, тем выше разрешающая способность микроскопа

длинна волны - 0.4 мкм, аппертура - 1.4 - предел разрешающей способности.

Разрешающая способность - свойство изображать мельчайшие детали препарата, характеризующиеся наименьшим расстоянием, при котором различают две точки, тесно расположенные др к др

Устройство:

- механическое: штатив, тубусодержатель, тубус, револьвер, предметный столик
- оптическое - объектив, окуляр, осветитель (зеркало, лампа, конденсор)

объектив характеризуется увеличением, фокусным расстоянием, разрешающей способностью, аппертурой,

окуляр - собирающая линза

общее увеличение микроскопа - увел окуляра*увел объектива

Фазово-контрастная. для наблюдения прозрачных непоглощающих объектов, отличающихся от среды показателем преломления. Вследствие этого различия световая волна проходит сквозь объект с разной скоростью, претерпевает изменения по фазе и приобретает фазовый рельеф. Фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно глазом или фотопластинкой, с помощью специальной фазовой пластинки (фазового кольца) переводят в амплитудные изменения(амплитудный рельеф), видимый глазом. световая волна приобретает фазовый рельеф.

Люминесцентная. основана на способности некоторых объектов светиться при освещении уф (люминесценция киш палочки в уф-диапазоне). Применяется как для фиксированных, так и для живых препаратов

живые:
- для изуч функц состояния и физ-хим характ
-выявления специф белков - связыв с опред красителем
-анализ изменений концентраций и распол специф макромолекул в живых клетках

Красители флюорохромы:
флуоресцеин - желто-зеленый, после возбуждения голубым диапазоном
родамин - темно красный, после возбуждения желто-зеленым диапазоном

Отличие от обычного микроскопа - источник света и наличие светофильтра в осветительной системе и после объектива. Первый - на осветителе, второй в окуляре - пропускает только люминесценцию препарата. Поглощается УФ - возбуждаются е - испускают свет

Как правило, спектр флуоресценции смещен по сравнению со спектром поглощения возбуждающего света в сторону более длинных волн (правило Стокса) – связано с перераспределением энергетических уровней молекул и уменьшением энергии кванта, излучаемого веществом, по сравнению с квантом поглощаемого света.. Цвет свечения зависит от химической структуры и физ-хим состояния объекта. УФ-микроскопия - для неокрашеннх объектов

Электронная микроскопия. Разрешение до 0.4 нм, вместо видимого света используется пучок электронов, в роли линзы - электрические и магнитные поля. В электронном микроскопе изображение строится за счет разности рассеивания электронов от соседних участков

Ценность - разрешение намного больше чем у оптики, тк у электрона малая длинна волны, только неживые препараты

контраст вызван отклонением ускоренных электронов тяжелыми атомами, входящими в состав препарата.

электронная пушка - 1 линза (конденсорная) - объект - 2 линза (объективная увеличивает) - 3 линза (проекционная) - экран или пленка

Качество изображения определяется контрастом, кот повышают солями тяжелых металлов (свинец, вольфрам, уран) –на объекте - позитивный контраст, фоном- негативный контраст. Биологические объекты исследуются на спец сетках, покрытых пленками из коллодия и формвара (хз что это).

применение метода: изучение тонкой структуры клеток, локализаций специфических макромолекул

Трансмиссионный ЭМ (просвечивающий, ПЭМТЭМ). Просвечивает тонкий препарат пучком электронов (вышеописаный механизм с тремя линзами) - изучение микроструктур клетки

Сканирующий ЭМ (растровый, РЭМСЭМ). Сканирует поверхность образца пучком электронов, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа. Различия в интенсивности отраженного излучения е преобразуются в изменение амплитуды эл сигналов, что регистрируется на экране или фотопленке. увеличение меньше, чем в ТЭМ, не больше 3-5 нм.

Преимущества сканирующей в сравнения с трансмиссионной: с ее помощью можно получать трехмерное изображение биологических объектов, изучать рельеф поверхности их отдельных клеток или составляющих клетки структур, различать детали строения поверхностей. Большая глубина резкости. Ее можно усилить, наклонив образец до 45 градусов.и с помощью динамического фокусирования.

В настоящее время широко используется СЗМ – сканирующий зондовый микроскоп, который для сканирования использует иглу. в результате получают трехмерное изображение поверхности с высоким разрешением