Характеристика ферментов, используемых в генетической инженерии. - Объекты биотехнологии и их промышленное использование

Наиболее важными ферментами, используемыми в генной инженерии, являются специфические эндонуклеазы (рестриктазы), ДНКлигазы и ДНКполимеразы.
Рестриктазы - Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) являются компонентом ферментативных систем рестрикциимодификации бактериальной клетки, основной функцией которых является защита ДНК от внедрения чужеродной. В соответствии с современной номенклатурой  различают три основных класса рестриктаз: I, II и III. Название фермента определяется первой буквой рода и двумя первыми буквами вида микроорганизма, из которого выделили фермент. Например, рестриктазы, выделенные из штаммов E. coli, обозначаются как Eco. Рестриктазы I представлены одним ферментом, и обладающим тремя активностями: рестрикционной, метилирующей и сенсибилитивной, ответственной за узнавание сайтамишени ДНК. Сайт узнавания рестриктаз I порядка представлен короткой двусторонней последовательностью. Такие рестриктазы режут ДНК в произвольных точках и образуют сплошной спектр рестриктов. Эти рестриктазы в генной инженерии не используются, поскольку с их помощью невозможно получить фрагменты ДНК заданных размеров. Рестриктазы III также представлены одним ферментом, состоящим из двух субъединиц. Одна субъединица ответственна за рестрикцию, другая – за модификацию и узнавание сайтамишени ДНК. Сайт узнавания – несимметричные последовательности. Сайт рестрикции отделен от участка узнавания на расстоянии 24–27 пар нуклеотидов. Для этих рестриктаз характерно то, что система рестрикции и модификации включаются одновременно и конкурируют за субстрат реакции. Рестриктазы II порядка представлены двумя отдельными белками, один из которых выполняет функцию рестрицирующей эндонуклеазы, а другой – модифицирующей метилазы. Поэтому можно выделить отдельный фермент, который будет обладать только эндонуклеазной активностью. Рестриктазы II порядка узнают и разрезают немодифицированную двухцепочечную молекулу ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям. Сайт узнавания для этих рестриктаз – короткая последовательность нуклеотидов, имеющая ось симметрии– палиндром.
Полимеразы ДНК-полимераза I обладает тремя активностями:

•                                                                                                                                   5'–3'полимеразная активность обусловливает синтез цепи ДНК. Субстратом служит однонитевая матрица ДНК.

•                                                                                                                                   5'–3'экзонуклеазная активность, вызывающая отщепление нуклеотидов от свободного 5Рконца. Субстратом реакции служит двухнитевая ДНК.

•                                                                                                                                   3'–5'экзонуклеазная активность, обеспечивающая отщепление со свободного 3ОНконца. Субстратом служит как одно, так и двухнитевая молекула ДНК. В генной инженерии часто используется большой так называемый «кленовский» фрагмент ДНКполимеразы I, у которого сохранены только полимеразная и 3’–5’экзонуклеазная активность. Кленовский фрагмент используют:                         для заполнения нуклеотидами выступающих однонитевых 5'концов, которые образуются при разрезании ДНК соответствующими рестриктазами;                      для введения радиоактивной метки в концы фрагментов ДНК; для введения радиоактивной метки в рестрикты с ровными концами. ДНК-полимераза фага Т4. Этот фермент обладает теми же активностями, что и «кленовский» фрагмент. Однако обнаружено, что у него 3'–5'экзонуклеазная активность более выражена, чем у «кленовского» фрагмента. Поэтому для введения метки в рестрикты с «тупыми» и выступающими однонитевыми 3'концами лучше использовать именно этот фермент. ДНК-полимераза фага Т7. В состав фермента входит тиоредоксин, который увеличивает процессивность полимеразы. Taq-полимераза. Этот фермент выделен из термофильных бактерий Thermits aquaticus, поэтому он термостабилен и способен реплицировать ДНК при 74 °С. Taqполимераза сохраняет половину своей функциональной активности после прогрева при 95 °С в течение одного часа. Она используется при ПЦР. РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза). РНКзависимая ДНКполимераза синтезирует ДНК на РНК и ДНКматрицах. С помощью обратной транскриптазы можно синтезировать копию любой части мРНК, выбрав для этого подходящий праймер. Поли(А)-полимераза. Полимеразу используют для подготовки РНК в качестве матрицы при синтезе ДНК, а также для введения в РНК 3'концевой метки. ДНК-лигазы. Эти ферменты способны объединять разорванные цепи. Причем эти ферменты могут связывать даже цепи ДНК с РНК, при этом матрицами служат комплементарные нити ДНК и РНК. В генной инженерии эти ферменты используются в основном для сшивания рестриктов, имеющих «липкие» (ДНКлигаза E. сoli и ДНКлигаза фага Т4) и «тупые» концы (ДНКлигаза фага Т4).РНК-лигазы. Они используются для введения метки в 3'конец РНК. Механизм действия этих ферментов аналогичен действию ДНКлигаз.