Характеристика используемых носителей, способы иммобилизации клеток и ферментов.

ИФ – это ферменты, сохраняющие свою активность при связывании с нерастворимыми носителями. для иммобилизации ферментов используют:

без возникновения ковалентных связей между ферментом и

носителем  -  физические метод

 - с образованием ковалентной связи между ними химические методы.

Физические методы ИФ:
Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. с использованием  носителей -  кремнезем, активированный уголь, пористое стекло, синтетические полимеры и т.д. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях  достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок).

Статический способ  носитель вносят в водный раствор фермента и полученную смесь оставляют на некоторое время без перемешивания. Иммобилизация достигается за счет самопроизвольной диффузии фермента к поверхности носителя с последующей адсорбцией. способ с перемешиванием при котором носитель суспендируется в растворе фермента и полученная смесь непрерывно перемешивается с помощью магнитной или механической мешалки или на лабораторной качалке.

метод электроосаждения  в раствор фермента погружают два электрода, на поверхность одного из которых помещают слой носителя. При включении электрического тока молекулы фермента начинают перемещаться в растворе в направлении соответствующего электрода и осаждаются на поверхности носителя.

нанесения в колонке. Существует две модификации этого метода: 1.колонку, заполненную носителем, с помощью насоса прокачивают в направлении сверху вниз раствор фермента в режиме непрерывной циркуляции. 2. раствор фермента подается в нижнюю часть колонки, скорость потока подбирается чтобы частицы носителя оставались во взвешенном состоянии, образуя «кипящий слой». Метод позволяет проводить нанесение фермента, промывку, а затем и сам ферментативный процесс в одной и той же колонке без дополнительных манипуляций с носителем.

К недостаткам адсорбционного метода невысокую прочность связывания фермента с носителем. десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции.

ИФ путем включения в гель.  применим для иммобил индивидуальных ферментов, мультиэнзимных комплексов и интактных клеток.

Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами.

 1. фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента.

 2.фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поли-винилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго - гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.
Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объеме носителя.
ИФ в полупроницаемые структуры. Сущность способа в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.
1. способ  раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером.

Достоинства метода микрокапсулирования - возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования).
включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

Химические методы ИФ.  путем образования новых ковалентных связей между ферментом
способ обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид и др.)

Для получения  ИФ используется  органические, неорганических носители.   К носителям предъявляются следующие требования :

-высокая химическая и биологическая стойкость;высокая химическая прочность; достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность; возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран); легкая активация; высокая гидрофильность; низкая стоимость.

органические полимерные носители (ОПН)

органические полимерные носители разделяют  на два класса: природные и синтетические полимерные носители.

каждый из классов ОПН подразделяется на группы в зависимости от их строения: Среди природных полимеров выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических — полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.

К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам — биодеградируемость и достаточно высокую стоимость.

Из полисахаридов используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Химической модификацией крахмала сшивающими г-агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель — губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам.

Из природных аминосахаридов применяют хитин, который в значительных количествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков  примен протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена — желатина.

Синтетические полимерные носители

К ним относятся полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтетических полимерных носителей обладают механической прочностью. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы).

Носители неорганической природы

В качестве носителей наиболее часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего, носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество— легкость регенерации неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Технология производства ферментов в промышленных условиях, требования, предъявляемые к продуцентам ферментов

 В качестве продуцентов ферментов используют: растения, животные ткани и микроорганизмы.

требование к применяемым продуцентам: способность к образованию большого количества какого-либо одного фермента при незначительном количестве других ферментов.

 М.о.  культивируют на средах, богатых углеводами, азотистыми и минеральными веществами, витаминами.

В производстве ферментных препаратов используют синтетические и комплексные среды

Синтетические среды готовят из различных минеральных солей и органических соединений, являющихся источником углерода — углеводов, спиртов, органических кислот. В качестве естественных материалов применяют отходы пищевых производств: отруби, мелассу, жмыхи и др.

Для накопления ферментов в культуральной среде необходимо обеспечить оптимальные условия для их синтеза: состав среды, температуру, значение рН, снабжение клеток кислородом воздуха.

Применяют два способа выращивания продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный.

Поверхностный способ выращивание микроорганизмов на поверхности твердых, жидких, полужидких или сыпучих материалов. Этот способ создает хорошие условия для максимального контакта микроорганизмов с кислородом воздуха. Его используют в основном при выращивании мицелиальных грибов.

Глубинный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на жидких средах. Этот способ применяют при использовании в качестве продуцентов ферментов бактерий и других микроорганизмов, способных интенсивно развиваться в условиях недостаточного контакта клеток с кислородом.

При поверхностном способе культивирования оптимальная температура для развития мицелиальных грибов 28...30 °С, бактерий 32...38 °С, относительную влажность воздушной среды на поверхности субстрата необходимо поддерживать в пределах 60.. .70 %. Обязательным условием этой технологии является аэрация растильной камеры.

Регулируя состав питательной среды, условия и длительность культивирования, можно достичь превалирующей активности одного фермента в комплексе ферментов препарата.

При глубинном культивировании отделяют клетки микроорганизмов от культуральной жидкости фильтрацией или центрифугированием. Фильтрат или центрифугат сгущают до концентрации сухих веществ 40 % или высушивают.

Полученные таким образом технические ферментные препараты могут использоваться в жидком виде или в виде порошка.

Для очистки ферментов применяют осаждение их из водных растворов органическими растворителями такими, как метиловый, этиловый, изопропиловый спирты, ацетон; высаливание сульфатами аммония, натрия, цинка, хлоридом натрия; фракционирование. Высушивание предварительно очищенных и сконцентрированных препаратов осуществляют в распылительных сушилках или методом сублимации.

Производство ферментных препаратов глубинным способом на жидких питательных средах можно разделить на следующие стадии:

— приготовление, стерилизация и охлаждение питательной среды;

— приготовление посевного материала и выращивание производственной культуры;

— отделение и сушка биомассы;

— фасовка отходов и отделение фильтрата;

— концентрирование и сушка концентрата;

— осаждение, сушка и стандартизация препарата;

— фасование препарата.