Векторные системы для клонирования в клетках эукариот: животных, растительных и дрожжевых

 Дрожжи.В их геноме нет оперонов, транскрипцию у них ведут три типа РНК-полимераз. Для клонирования и экспресии обычно используют сахаромицеты –Saccharomyces cerevisiae. легко проводить скрининг клонов, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК.

При клонировании в дрожжевых клетках фрагментов ДНК используют челночные векторы, способные к самостоятельной репликации в дрожжах и бактериях благодаря присутствующим в них ori-сайтам дрожжевых и бактериальных плазмид. из дрожжевых клеток трудно выделить значительное количество векторных молекул. Выделение векторов и рекомбинантных ДНК из дрожжей ведут  в два этапа. Сначала из трансформированных дрожжей выделяют суммарную ДНК, затем с ее помощью трансформируют клетки E.coli и по селективным признакам отбирают клоны с челночными векторами. Известные типы дрожжевых векторов. Векторы типа YIp (YeastIntegratingplasmid) являются бактериальными векторами, дрожжевая ДНК в них представлена только одним геном. не способны реплицироваться в дрожжевых клетках, но осуществляют их трансформацию путем интеграции в хромосому через рекомбинацию дрожжевого гена с гомологичным участком и путем замены хромосомного гена на векторный с помощью двойного кроссинговера. Векторы типа YEp (YeastEpisomalplasmid) Эти челночные векторы позволяют клонировать чужеродные гены в клетках E.coli и затем исследовать их экспрессию в дрожжевых клетках. Частота трансформации в 3 раза выше по сравнению с векторами первого типа, получаемые трансформанты нестабильны. Векторы типа YRp (YeastReplicatingplasmid) имеют хромосомные репликаторные последовательности ars (autonomouslyreplicatingsequence), которые были найдены около генов trp1(ars1) и arg4 (ars2), а также в других участках дрожжевых хромосом. слабо обеспечивают самостоятельную репликацию векторов,трансформанты дрожжей нестабильны. Лучшие векторы типа YCp, содержащие, кроме хромосомных репликаторов ars1 и ars2, центромеры дрожжевых хромосом. для конструирования векторов применяют центромеры 3-й (CEN3) и 11-й (CEN11) хромосом. векторы YCp проявляют стабильность при митозе и мейозе. Наиболее используемыми дрожжевыми векторами являются сконструированные in vitro гибридные ДНК из дрожжей и E.coli. Эти векторы дают возможность исследователю переносить плазмиду из одного хозяина в другой.

Клонирование в клетках животных.

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера.

Селективные маркеры дают возможность вводить в клетки млекопитающих любой ген, заранее лигированный с клонированным селективным маркером.

челночный вектор и  их рекомбинантные производные, способных к репликации в животной и бактериальной клетках, экспрессирующие клонируемый ген в животной клетке. К числу таких векторов можно отнести векторы из плазмиды pBR322,SW-40.

Чужеродная ДНК замещает существенные гены, в результате чего рекомбинантные вирусы утрачивают способность к репликации.

Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений с целью изменения свойств организма, таких, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Работы были начаты яйцами амфибий, а затем продолжены с яйцеклетками и эмбрионами мыши.

Обычно гены транспортируют, на ранних стадиях развития животного (в большинстве случаев на стадии зиготы и двухклеточных эмбрионов).