Введение векторной ДНК в клетки хозяина

Определение терминов и понятий, связанных с введением чужеродной ДНК.

Трансформация – проникновение экзогенной ДНК в клетку-реципиент с последующими наследственными изменениями генома клетки. Трансформацию могут осуществлять как внехромосомные (неинтегративные), так и интегрирующиеся молекулы ДНК.

Трансформанты – генетически трансформированные клетки.

Трансфекция  – введение в клетку НК вируса с образованием вирусного потомства.

Трансдукция – введение ДНК в клетку с помощью бактериофага.

Бляшки = то же, что инфекционные центры, негативные колонии – очаги лизиса бактериальных клеток в сплошном покрове бактерий (бактериальном газоне) в результате инфицирования бактериофагом и распространения данной инфекции между клетками.

Трансфектанты – вирусные клоны, полученные из отдельных бляшек.

 Wikipedia: Insertion of a vector into the target cell is usually called transformation for bacterial cells, transfection for eukaryotic cells, although insertion of a viral vector is often called transduction. Transformation is the genetic alteration of a cell resulting from the direct uptake, incorporation and expression of exogenous genetic material (exogenous DNA) from its surroundings and taken up through the cell membrane(s). Transduction (injection of foreign DNA by a bacteriophage virus into the host bacterium).]

Для успешного молекулярного клонирования клетки должны быть пермиссивными, т.е. обеспечивать репликацию гибридных молекул.

Компетентность (употребляют также термин восприимчивость) – физиологическое состояние клетки, когда она способна поглощать нуклеиновую кислоту из окружающей среды. Многие клетки бактерий, а также большинство дрожжей и культивируемые клетки растений и животных такой физиологической компетентностью в обычных условиях не обладают.

Способы получения компетентных клеток. Для трансформации добиваются индуцированной компетентности тремя основными способами:

(1) Получение протопластов и сферопластов. Это первый из изобретенных способов индуцирования компетентности для бактерий. При этом проводится полный ферментативный гидролиз клеточных стенок с получением протопластов (клетки, ограниченные только плазмалеммой). Применяются: фермент лизоцим либо пищеварительный сок виноградной улитки. Разрушение клеточной стенки производят в изотоническом растворе, чтобы клетки, лишившись стенки, не полопались. Если после ферментативной обработки у клеток сохраняются фрагменты клеточной стенки или внешняя мембрана, то такие клетки называются сферопластами. Эффективность трансфекции сферопластов голой фаговой ДНК составляет до 10-3 БОЕ (бляшкообразующих единиц) на одну молекулу ДНК фага лямбда.

(2) Получение кальциевых компетентных клеток. Этот метод более прост, чем получение прото/сферопластов. Культуры (например, E. coli), обрабатывают CaCl2 на холоде (0ºC) с последующим тепловым шоком (37ºC), что приводит к поглощению добавленных в среду молекул ДНК. Например, голая ДНК фага лямбда таким образом попадает в клетки (так называемая CaCl2-зависимая трансфекция E. coli), что завершается образованием инфекционного фагового потомства. Эффективность метода составляет до 10-4 БОЕ на 1молекулу ДНК фага лямбда.

(3) Электропорация – более удобный метод: пробой клеточной мембраны в результате кратковременного воздействия (5-20 мс) электрического поля высокой напряженности (1-15 кВ/см). ДНК входит через поры под действием осмотических сил. Эффективность применения электропорации для трансформации E. coli высока. В оптимальных условиях количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. Разрушения клеточной стенки для бактерий при этом не требуется, т.к. стенка имеет естественные поры, и задача состоит только в образовании пор в фосфолипидных мембранах: In addition to the lipid membranes, bacteria also have cell walls which are different from the lipid membranes and are made of peptidoglycan and its derivatives. However, the walls are naturally porous and only act as stiff shells that protect bacteria from severe environmental impacts. Помимо бактерий, электропорация применяется на дрожжах, протопластах растений, культивируемых клетках животных.