С одной стороны, конструирование вектора – процесс вероятностный, т.е. фрагмент чужДНК включается не во все векторные молекулы. С другой стороны, трансформация клеток – это тоже вероятностный процесс, т.е. векторная ДНК может проникнуть, а может не проникнуть в клетку. Чтобы проследить, каков успех трансформации, необходимо выявить трансформант по каким-то признакам. Особенно это актуально, если в один и тот же вектор случайным образом встраивается набор различных фрагментов ДНК. Таким образом, главный вопрос, который возникает у генетических инженеров – какие клетки при этом приобретают вектор с тем или иным фрагментом?
Для отбора клеток, содержащих целевые гибридные ДНК, применяется встраивание в вектор маркера с фенотипическим проявлением, т.е. фенотипическая система селекции. Нередко вектор на основе природных плазмид уже содержит тот или иной фенотипический маркер. Для бактерий наиболее распространенный маркер – это ген(ы) устойчивости к антибиотику(кам).
Рассмотрим процесс фенотипической селекции трансформантов на характерном примере. Пусть плазмида, используемая в качестве вектора, содержит два гена устойчивости: к антибиотику тетрациклину (Tc) и антибиотику ампициллину (Ap), т.е. клетки, содержащие данную плазмиду, имеет фенотип TcRApR (индекс R означает «устойчивый» - resistant). Допустим, что встройка чужеродного фрагмента ДНК происходит по сайту узнавания рестриктазой, который находится в пределах гена устойчивости к ампициллину. После встройки данного фрагмента этот ген нарушается, и получившийся плазмидный вектор будет нести фенотип TcRApS (индекс S означает «чувствительный» - sensitive). Для трансформации используют клетки бактерий, обладающих фенотипом TcSApS. После обработки восприимчивых клеток векторной ДНК, производят первый этап фенотипической селекции. Для этого суспензию предположительно трансформированных клеток высевают на поверхность плотной среды, содержащей тетрациклин. Колонии, выросшие на среде с тетрациклином, буду содержать или исходные плазмиды, или гибридные плазмиды. Бактериальные клетки без плазмид не будут развиваться на данной среде. На втором этапе селекции производят перепечатку (реплику) с чашки Петри с тетрациклином, на чашку Петри с плотной среды, содержащей ампициллин. Колонии, которые после перепечатки не будут давать роста на среде с ампициллином, содержат только гибридные плазмиды, поскольку у гибридных плазмид ген устойчивости к данному антибиотику поврежден. Перепечатка, или реплика – это пересев колоний бактерий специальным круглым штампом, обтянутым стерильным бархатом, с поверхности плотной среды из одной чашки Петри в другую, содержащую стерильную среду, с условием точного сохранения пространственного расположения колоний.
Схема процесса фенотипической селекции гибридных клонов
Поможем написать любую работу на аналогичную тему