Стабильность гибридных молекул ДНК в клетках E. coli

В связи с применением молекулярных векторов на практике, важно знать, насколько стабильны они в бактериальных клетках при многочисленных пересевах штамма.

Бактериальные внехромосомные молекулы ДНК характеризуются определенной степенью нестабильности, т.е. они не могут наследоваться бесконечно при делении клетки и не могут бесконечно сохранять свою генетическую структуру в неизменном виде.

Наиболее хорошо у прокариот изучена проблема нестабильности плазмид у E. coli.

Существует 2 типа нестабильности плазмид in vivo: сегрегационная – утрата в процессе деления клеток, и структурная – изменение структуры.

Структурная нестабильность заключается в том, что плазмиды подвергаются спонтанным генетическим изменениям: (1) точечным заменам нуклеотидов, (2) делециям, (3) дупликациям, (4) инверсиям, (5) встройке элементов типа IS (insertion sequence) и Tn (транспозонов).

a) Обычно всякого рода мутации не дают плазмиде селективных преимуществ в размножении. Поэтому по преимуществу плазмиды без мутаций сохраняются в растущей бактериальной культуре. б) если же дают преимущества, то исходная плазмида будет постепенно вытесняться в культуре мутантной формой. в) если наличие плазмиды снижает жизнеспособность, популяция будет постепенно обогащаться безплазмидными клетками. Обычно различия в скорости размножения клеток с и без плазмиды проявляются при дефиците какого-либо фактора среды, необходимого для роста (и дефицит которого компенсируется генотипом плазмиды).

Стабильность плазмиды определяется в основном ее генотипом.

Было обнаружено, что существуют специальные молекулярные механизмы распределения плазмид при делении клетки, при этом стабильность наследования не зависит от копийности плазмиды. Генетический локус (набор генов), ответственный за равномерное распределение плазмид при делении, был назван par (partition).

Например, в плазмиде pSC101 локус par находится возле локуса ori. Введение локуса par из pSC101 в менее стабильные плазмиды приводит к повышению их стабильности.

В F-плазмидах локус par включает несколько генов, кодирующих белки, участвующие в процессе разделения плазмид. Размер такого полного локуса par – 2.8 т.п.н. Один из его элементов служит для связывания плазмидных белков разделения и некоторых белков клетки-хозяина, и такой ДНК-белковый комплекс называется партисомой.

Как показали эксперименты по сохранности плазмид в клетках E. coli, при длительных пересевах число плазмидсодержащих клетов убывает в виде плавной кривой, и после 300-350 клеточных делений клетки теряют плазмиды вовсе. Причем индивидуальные клоны E. coli различаются по темпам утраты плазмид (см. диаграмму). Плазмиды с большей копийностью поддерживаются «с большим успехом», т.е. начинают исчезать из части клеток после 200 делений.

Генно-инженерные элементы, снижающие стабильность плазмидных векторов:

а) наличие сильного промотора (интенсивная траскрипция может подавлять репликацию и снижать копийность плазмиды);

б) экспрессирующие векторные плазмиды, вызывающие сверхсинтез белка, часто приводят к утрате плазмиды или мутациям в ней;

в) наличие протяженных тандемных повторов в составе гибридной плазмиды ведет к ее структурной нестабильности (делеции таких повторов);

Для поддержания штамма с плазмидой прибегают к методам атоселекции. Автоселекция плазмидсодержащих клеток – это культивирование их в таких условиях, когда клетки, теряющие плазмиду, лишены возможности размножаться. Например, по методу Мива и соавторов (1984) возможен отбор клеток на средах без антибиотиков:

В качестве бактерии-хозяина использован штамм E. coli со стрептомицинзависимым фенотипом (Smd). Целью эксперимента было маскировать этот фенотип (сделать его стрептомициннезависимым - Smi) с помощью плазмидного вектора. Для этого в состав вектора pBR322 встраивали хромосомную ДНК штамма E. coli, не имеющего фенотипа Smd. Вектором трансформировали E. coli Smd, и отбирали клоны с фенотипом AprSmi. В результате был выделен ген rpsL, определяющей стрептомициннезависимый фенотип. Встройка этого гена в любой плазмидный вектор обеспечивает ее стабильное поддержание в штамме E. coli Smd на среде без стрептомицина. Бесплазмидные клетки на такой среде не растут, а жизнеспособны только клетки, несущие гибридные плазмиды с геном rpsL.