Векторы, применяемые в грамотрицательных бактериях, не относящихся к роду Escherichia

Необходимость разработки специфических векторов для разных семейств и родов бактерий обусловлена тем, что нередко регуляторные элементы генов бактерии одного семейства (рода), содержащиеся в плазмиде, не работают в клетках бактерий другого семейства (рода). Альтернатива – это разработка векторов для широкого круга хозяев среди бактерий.

Создание плазмидных векторов, способных реплицироваться в клетках разных хозяев, позволяет не только сэкономить время по реконструкции вектора для каждого из хозяев, но и изучить экспрессию клонируемого гена в различном генетическом окружении, но в составе одной и той же генетической конструкции.

Плазмидные векторы грамотрицательных бактерий подразделяют на:

1) на основе плазмид широкого круга хозяев; включая:

1а) на основе плазмид группы несовместимости IncP;

1б) на основе плазмид группы несовместимости IncQ;

2) бифункциональные (челночные) векторные плазмиды.

Рассмотрим некоторые особенности плазмид грамотрицательных бактерий. Плазмиды являются репликонами – т.е. способны самостоятельно реплицироваться in vivo. В одних случаях плазмида сама кодирует белки, обеспечивающие относительную автономность ее репликации, а в других – репликация определяется только ферментной системой бактерии. Свойства, несомые плазмидами и выявляемые на уровне фенотипа, могут быть: детерминатны устойчивости (у R-плазмид, R – от слова resistance), гены, определяющие деградацию некоторых органических соединений (D-плазмиды, от 'degradation'). Плазмиды, наличие которых не выявляется на уровне фенотипа, называются криптическими. Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды способны к конъюгационному переносу (при непосредственном контакте клеток), нетрансмиссивные (неконъюгативные) – не способны к такому переносу. Конъюгативный перенос обеспечивается набором генов, объединенных в tra-оперон. Для образования скрещивающихся пар необходимы половые ворсинки – пили. Нетрансмиссивные плазмиды не содержат генетических детерминант, придающих бактериальным клеткам свойства доноров, однако такие плазмиды иногда могут быть перенесены в реципиентные клетки с помощью конъюгативных плазмид. Такой процесс называется мобилизацией.

Известно 2 механизма мобилизации:

1. Перенос за счет белковых продуктов гена tra-оперона конъюгативной плазмиды, находящейся в этой же клетке. Перенос начинается с собственного участка oriT мобилизуемой плазмиды, и для его осуществления мобилизуемая плазмида должна содержать гены mob. так мобилизируются ColE1 и RSF1010. Сама плазмида-помощник может не проникать при этом в реципиентную клетку.

2. Перенос в составе коинтегранта с конъюгативной плазмидой. Коинтегрант – кольцевая молекула ДНК, в которой соединены 2 или более репликона, способных к независимой репликации.

Изучение разнообразных плазмид показало, что часть из них не могут стабильно сосуществовать в клетке. Явление было названо несовместимостью плазмид. По этому признаку плазмиды распределены на группы несовместимости (Inc-группы). К одной такой Inc-группе относят плазмиды, несовместимые между собой, но совместимые с любой плазмидой из других групп. Плазмиды из одной Inc-группы часто обладают значительным сходством (гомологией) ДНК.

Плазмиды с широким кругом хозяев – способные реплицироваться в бактериях разных видов. Для грамположительных бактерий это явление более распространено. Для грамотрицательных такие плазмиды менее распространены, и часто нестабильны в «не основном» хозяине. Всего, например, у E. coli установлено 37 групп несовместимости плазмид. Наиболее подробно изучены плазмиды из групп несовместимости, обозначаемых латинскими буквами P и Q. Плазмиды этих групп способны передаваться в грамотрицательные бактерии всех родов через конъюгационно-транспортную систему, и реплицироваться в разных хозяевах, кроме рода Bacteroides, в клетки кторорых плазмиды переносятся, но не реплицируются.