Определение жизнеспособных клеток.

Чтобы определить общее количество микроорганизмов в различных материалах, применяют методы прямого подсчета клеток под микроскопом.

2. Подсчет клеток на мембранных фильтрах Этот метод используют для подсчета количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате фильтрации определенного объема исследуемой пробы с окрашиванием и подсчетом в микроскопе. С помощью мембранного фильтр-ния могут быть подсчитаны как жизнеспособные клетки микроорганизмов, так и общее кол-во кл-ок.

При определении количества жизнеспособных клеток микроорганизмов с помощью мембранных фильтров если фильтр с находящимися на его поверхности микроорганизмами поместить на агаризованную питательную среду, то питательные вещества, проникая через поры фильтра, обеспечивают возможность формирования колоний, различимых невооруженным глазом. Подсчитав колонии, выросшие на поверхности фильтра после соответствующего инкубирования, определяют количество жизнеспособных клеток микроорганизмов, которые были им задержаны. Этот метод аналогичен методу подсчета клеток на чашках, но является более чувствительным, поскольку через фильтр можно пропускать практически неограниченные объемы исследуемого материала. После проведения фильтрования с соблюдением стерильности, мембранный фильтр снимают пинцетом и помещают на поверхность 1,5 % агаризованной среды в чашке Петри. Следят за тем, чтобы между фильтром и средой не образовывалось пузырьков воздуха. Чашку помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре. При подсчете колоний для увеличения контрастности мембранный фильтр с колониями окрашивают. Для этого поверхность фильтра, находящегося в чашке Петри, заливают 0,01 % водным раствором оксалата малахитового, который через 8 – 10 с сливают. При этом способе окрашивания колонии выглядят белыми или желтыми на фоне зеленого фильтра. Рассчитывают количество жизнеспособных клеток в 1 мл исследуемого материала.

Метод подсчета клеток на мембранных фильтрах с помощью люминесцентного микроскопа заключается в концентрировании бактерий на нелюминесцирующий мембранный фильтр, флюорохромировании акридиновым оранжевым и подсчете клеток в специальном (люминесцентном) микроскопе. Этот метод удобен тем, что позволяет непосредственно подсчитать как общее количество клеток, так и количество жизнеспособных клеток. При окрашивании акридиновыми красителями жизнеспособные клетки имеют зеленую, а нежизнесобные (мертвые) – красную окраску.

Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В определенных пределах рассеивание света клетками пропорционально их численности.  Величину светорассеяния измеряют с помощью нефелометров, спектрофотометров или фотоэлектроколориметров.

Для построения калибровочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величину светорассеяния взвеси с различным содержанием клеток и в каждой из них одним из доступных способов подсчитывают количество клеток в единице объема. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на осях: абсцисс – показания нефелометра, ординат – количество клеток, содержащихся в 1 мл. Калибровочные кривые индивидуальны для каждой культуры.

При посеве на поверхность агара (метод Коха) проводят три этапа: приготовление разведений исследуемого материала, посев на агаризованную среду в чашках Петри и подсчет сформировавшихся колоний.Разведения готовят в физиологическом растворе, шаг разведения 10-1. Высевы на плотн. среду проводят из трех последних разведений, причем делают два параллельных высева.  При расчете количества клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии суммируют результаты параллельных высевов из одного и того же разведения и определяют среднее количество колоний для данного разведения. Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на агаризованной питательной среде сформировалось от 30 до 300 колоний. где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее количество колоний при высеве из данного разведения; V – объем 84 асуспензии в мл, взятой для  посева; 10 – коэффициент разведения; n – порядковый номер разведения.

Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной агаризованной средой. Содержим. чашки перемеш. и дают среде застыть. Метод посева в тонком слое предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 – 3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.