Конъюгация – процесс генетического обмена, сопровождающийся переносом генетической информации от клетки донора к клетке-реципиенту, который осуществляется при непосредственном контакте клеток между собой.
Открыта Дж. Ледербергом и Э. Татумом в 1946 г. в экспериментах с полиауксотрофными штаммами бактерий E. coli.Они пытались доказать существование генетической рекомбинации у бактерий E. coli. Два ауксотрофных мутантных штамма E. coli генотипы: штамм А – met– bio– thr+ leu+ thi+, штамм В – met+ bio+ thr– leu– thi– . Культуры смешивали и инкубировали при оптимальных условиях в течение промежутка времени. Центрифугировали и высевали на агаризованную минимальную глюкозо-солевую среду. После инкубир 37.С на этой среде сформировались колонии met+ bio+ thr+ leu+ thi+.
Выяснилось, что происхождение таких рекомбинантов нельзя объяснить трансформацией, так как
для их появления необходим непосредственный контакт между бактериями штаммов А и В.
В 1949 г. Б. Дэвис получил дополнительные данные, эксперимент в U-образной пробирке.
Позднее У. Хейс показал, что существуют бактерии мужского (доноры) и женского (реципиенты) типа и вклад их в конъюгацию не равнозначен. Перенос генетического материала происходит в одном направлении – от донора к реципиенту и процесс рекомбинации протекает в клетках штамма-реципиента.
У. Хейс ввел понятие о наличии в донорных клетках F-фактора (fertility – плодовитость) и обозначил доноры F+-клетками, а реципиенты – F–-клетками. Механизм передачи хромосомных генов при конъюгации был объяснен Ф. Жакобом и Е. Вольманом в середине 1950-х годов. Этому способствовало:
• выделение донорных штаммов, которые с высокой частотой передавали хромосомные гены в реципиентные клетки. В результате рекомбинации генов донорной хромосомы с хромосомой реципиента образовывались рекомбинанты по разным признакам. Такие донорные штаммы получили название Hfr соответственно первым буквам от английского high frequency of recombination;
• разработка в лаборатории А. Львова метода скрещивания с прерыванием конъюгации, суть которого заключается в том, что если в процессе скрещивания производить механическое встряхивание,
то формирующиеся конъюгационные пары разрушаются и перенос генов
прерывается.
Вывод, что перенос генетического материала от Hfr-донора в реципиентные F–-клетки происходит ориентированно, т. е. в том же порядке, в каком гены расположены на хромосоме. Точка, с которой начинается передача хромосомы, называется точкой начала переноса или ориджин (обозначается «оri» или «о»). В настоящее время образование Hfr-штаммов объясняют моделью, предложенной А. Кемпбеллом: F-фактор, имеющий, как и хромосома, кольцевую структуру, в своем составе несет нуклеотидные последовательности, гомологичные последовательностям бактериальной хромосомы. Ими являются IS2-, IS3-элементы и транспозон Tn1000. В F-факторе присутствуют два IS3-элемента – один IS2-элемент и один транспозон Tn1000, а в хромосоме бактерий E. coli имеются шесть или более копий IS2-элемента, до пяти копий IS3-элемента и несколько копий Tn1000, которые могут локализоваться в различных ее участках. За счет IS-элементов, транспозонов F-фактора и хромосомы происходит гомологичная рекомбинация с последующей интеграцией F-фактора в хромосому.
Таким образом, можно считать, что в зависимости от состояния F-фактора различают два типа донорных клеток: • F+-доноры, у которых F-фактор находится в автономном от хромосомы состоянии. При скрещивании F+-доноров с F–-реципиентами передается, как правило, только F-фактор;
• доноры Hfr-типа, у которых F-фактор интегрирован в хромосому. При скрещивании Hfr-доноров с F–-реципиентами передаются хромосомные гены с образованием рекомбинантов:
Интеграция F-фактора в бактериальную хромосому обратима. F-фактор может исключаться из хромосомы, и в этом случае клетка Hfr становится F+-клеткой. Процесс вырезания, или эксцизии, F-фактора происходит примерно с такой же частотой, что и интеграция. Однако в редких случаях может происходить неправильная эксцизия F-фактора из бактериальной хромосомы, что свя-зано с незаконной или запрещенной рекомбинацией, возникающей между негомологичными генетическими участками полового фактора и хромосомы. В результате такого процесса незаконной рекомбинации в состав полового фактора включается фрагмент бактериальной хромосомы.
F-факторы, содержащие фрагменты хромосомной ДНК, получили название F’-факторов, а штаммы содержащие такие F’-факторы – F’-донорами или донорами промежуточного типа.
В соответствии с величиной фрагмента хромосомы, интегрированного в состав F’-фактора, различают малые и большие F’-факторы. Малые F’-факторы несут в своем составе один ген, большие – до половины бактериальной хромосомы.
F’-факторы, как и обычные F-факторы, с высокой эффективностью
передаются при конъюгации F–-клеткам.Такой тип передачи генов получил название сексдукции или F-дукции, что схематично можно изобразить следующим
образом: F’lac+*F-lac-=lac-/ F’lac+
В результате скрещивания такого типа реципиентная клетка приобретает способность к сбраживанию лактозы и несет аллель как lac+ (находится в составе F’-фактора), так и аллель lac– (в хромосоме). Клетки, в которых определенные нуклеотидные последовательности представлены в двойном наборе – в составе хромосомы и в F’-факторе, называются гетерогенотами. У них обнаружена повышенная способность к образованию Hfr-клеток. При этом интеграция F’-фактора осуществляется в области хромосомы, гомологичной фрагменту, включенному в состав F’-фактора. В противоположность этому, F-фактор F+-клетки не имеет предпочтительного места соединения с хромосомой.
На первых этапах после смешивания донорных и реципиентных клеток в результате случайных контактов формируются конъюгационные пары. Контакты клеток беспорядочны. Однако установлено, что скорость конъюгации в определенных пределах пропорциональна концентрации бактерий.Обычно донорных примерно в 10 раз меньше, чем реципиентных бактерий.
С помощью электронного микроскопа показано, что между клетками в таких парах образуется конъюгационный мостик. Половые пили обеспечивают взаимное узнавание при контакте донорных и реципиентных клеток. Они прикрепляются к специфическим рецепторам, находящимся на поверхности реципиентных клеток. Благодаря способности половых пилей сокращаться, клетки донора и реципиента вступают в контакт «клеточная стенка к клеточной стенке», а затем между клетками возникает более сложное образование – конъюгационный мостик, по которому ДНК переходит из клетки-донора в клетку реципиента.
Во время конъюгации в донорных клетках осуществляется репликация ДНК по типу «катящегося кольца» или «разматывающегося рулона». Для этого фермент эндонуклеаза в точке начала передачи F-фактора разрезает одну из нитей ДНК с образованием 5.- и 3.-ОН-концов. На 3.-ОН- конце с помощью ДНК-полимеразы III происходит наращивание нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам неповрежденной нити ДНК. Второй конец (5.-конец) разрезанной нити начинает отходить в виде «хвоста» и переходит по конъюгационному мостику в реципиентную клетку, где служит матрицей для синтеза второй нити. После репликации в реципиентной клетке двухцепочечная ДНК вступает в гомологичную рекомбинацию с ДНК реципиентной клетки. Образуются рекомбинанты, которые при данном способе обмена генетической информацией называются трансконъюгантами.
Таким образом, в процессе конъюгации можно различить следующие стадии:
образование неэффективных пар/эффективных конъюгационных пар/перенос генетического материала/постконъюгационный синтез донорной ДНК в реципиентной клетке/гомологичная рекомбинация перенесенного фрагмента донорной ДНК с ДНК реципиентной клетки.
Как способ генетического обмена конъюгация используется в следующих направлениях.
1. Передача многих генетических маркеров из одних клеток в другие.
2. Метод конъюгационного скрещивания удобен для картирования хромосомы. Карта хромосомы у бактерий строится в минутах. У бактерий E. coli началом карты (0 мин) являются точки треон и лейц.
3. Изучение генетического аппарата у бактерий. 4. Изменчивости бактерий.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему