Молекулярно-генетические признаки в систематике: специфичность нуклеотидного состава, методы ее определения; ДНК-ДНК гибридизация; применение генетических зондов

Первые данные о такой специфичности появились в конце 50-х годов XX века. Процент ГЦ пар – это самая первая из разработанных характеристик генома, которая стала использоваться в систематике прокариот. Оказалось, что организмы с различающимся %ГЦ пар относятся к разным видам, а у неродственных видов могут быть сходные значения нуклеотидного состава. Поэтому метод не помогает установить связи дальнородственных видов. Тем не менее, по сей день определение %-ного содержания (молярного %) ГЦ пар является частью стандартной процедуры описания таксонов бактерий. Метод определения: (1) по кривой плавления ДНК; (2) путем гидролиза ДК и разделение нуклеотидов; (3) путем жидкостной хроматографии; (4) путем определения плавучей плотности; (5) через бромирование. Общее число пар ГЦ является постоянной характеристикой данного вида бактерий. Содержание ГЦ для прокариот варьирует от 20 до 80%. Показано, что микроорганизмы, различающиеся между собой более чем на 10% по доли ГЦ, не принадлежат к одному роду. Штаммы одного вида не различаются между собой более, чем на 5%. ДНК-ДНК гибридизация (тотальной ДНК). Многочисленные данные подтверждают высокую корреляцию между результатами ДНК-гибридизации и фенотипическими характеристиками. В этом методе выделяется тотальная клеточная ДНК и фрагментируется ультразвуком на отрезки длиной 300-350 п.н. Саузерн-блот гибридизация: Фрагменты переводятся в одноцепочечное состояние (цепи реассоциируются). Одноцепочечную ДНК фиксируют на нитроцеллюлозном мембранном фильтре. ДНК сравниваемого штамма также реассоциируют, и, кроме того, каждый из фрагментов химическим путем связывается с радиоактивной меткой. Меченые радиоактивным изотопом фрагменты ДНК другого организма денатурируют и раствор (в буфере) наносят на фильтр с фиксированной ДНК. Реакцию гибридизации проводят в специальных условиях (оптимальные условия – около 25С ниже температуры плавления нативной ДНК). Негибридизировавшие фрагменты отмывают. Путем авторадиографии (в жидкостном сцинтилляционном счетчике) оценивают количество образовавшихся гибридов. Уровень гибридизации между ДНК одного и того же штамма (гомологичной ДНК) принимают за 100%. Метод также не позволяет установить отдаленные родственные связи видов, а позволяет оценить границы видов, т.е. отношения внутри рода; иногда можно оценить границы родов бактерий.