Молекулярная гибридизация 16S рРНК. Рибосома прокариот состоит из 3 субъединиц, большой (23S), (5S) и (16S). Ген 16S рРНК обладает следующими свойствами, важными в филогении:
1. РНК рибосом универсальна для разных видов, как и сами рибосомы. 2.Молекула 16S рРНК – консервативна и наименее подвержена изменениям в ходе биологической эволюции. Скорость изменения гена 16S рРНК у различных бактерий-симбионтов составила 2-4% замен нуклеотидов в течение 60 млн. лет.3. Ген 16S рРНК имеет как ультраконсервативные, так и вариабельные области (домены), что дает возможность оценивать отдаленные и близкие родственные отношения.4. Кроме того, было установлено, что цистроны рРНК не вовлекаются в процессы межвидового генетического переноса.5. Размер гена (у прокариот он примерно 1550-1640 п.н. длиной) оптимален с точки зрения снижения статистических ошибок. Полный сиквенс можно определить за одно секвенирование методом Сэнгера.Сравнение нуклеотидных каталогов. Метод применялся в начале 80-х годов и имел большое историческое значение в систематике бактерий. При этом молекула РНК (16S рРНК) обрабатывалась рибонуклеазой Т, расщепляющей молекулу по остаткам гуанина. Размер полученных фрагментов составлял не более 20 нуклеотидов. Полученные олигонуклеотиды разделяли путем 2-мерного электрофореза, секвенировали, и составляли каталог, специфично характеризующий молекулу рРНК. При сравнении каталогов учитывались фрагменты длиной не менее 6 нуклеотидов. Путем применения коэффициентов сходства между каталогами впервые было построено общее филогенетическое дерево для прокариот. Рибопринтинг. Метод основан рестрикционном анализе генов рРНК. Для этого выделяют тотальную ДНК из клетки. Берут два праймера, гомологичных к высоко консервативным, фланкирующим участкам 16S рРНК (small subunit - ss rDNA) гена и проводят ПЦР. Фрагменты обрабатываются несколькими эндонуклеазами рестрикции, и продукты рестрикции для каждой из эндонуклеаз разделяются в агарозном геле вместе с профилем размерного стандарта ДНК. Полиморфизм длин фрагментов возникает благодаря тому, что часть сайтов рестрикции попадают в консервативные домены гена, а часть – в вариабельные домены. При этом часть фрагментов будут общими для всех видов в выборке. По количеству общих и различающихся фрагментов можно вычислять генетическую дистанцию между видами. Применение 12 рестриктаз с сайтами узнавания длиной в 4 нуклеотида позволяет охватить анализом 10-15% длины гена 16S рРНК, не прибегая к секвенированию.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему