Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило название метода культуры изолированных тканей.
Асептика. культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток требует соблюдения полной асептики. М.о, которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирующие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар-боксе/асептических комнатах. Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 1,5 —2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и повышенном давлении в течение 15 — 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 °С. Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация: часть растения, из кот будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах, в сост кот обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие кл деления. Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фосфата способствует быстрому росту клеток. При пригот тв пит сред для поверхностного выращивания каллусных тк исп очищенный агар-агар — полисахарид, получ из морских водорослей/ Среда Мурасиге и Скуга пригодна для образования каллусов, поддержания его неорганизованного роста, индукции морфогенеза у б-ва двудольных растений. Изменение соотн ауксина и кинетина приводит к обр либо корней (преобл ауксина)/стеблевых к-р (преобладание кинетина). Среда Гамборга и Эвелега хорошо подходит для культивирования клеток и тканей бобовых растений и злаков, среда Уайта обесп укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации.
Физические факторы. Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. Аэрация.показано, что синтез 2х метаболитов в суспензионной культуре был наибольшим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии. Влажность. Опт влажность в помещении, где растут культуры, 60 — 70%.
Поможем написать любую работу на аналогичную тему