Молекулярные векторы грамотрицательных бактерий на основе плазмид группы несовместимости IncQ - Молекулярные вектора (векторные системы). Лекции.

Плазмиды группы IncQ имеют репликационный аппарат значительной автономности, что и позволяет им поддерживаться в чрезвычайно широком круге хозяев.

Пример наиболее известной плазмиды из этой группы – RSF1010 (природная плазмида). В области, несущественной для репликативных функций, данная плазмида имеет участки узнавания для 4 рестриктаз: EcoRI, SstI, BstE2, PstI. Тем не менее, гены устойчивости к сульфаниламидам и стрепломицину составляют единый оперон, транскрибируются с одного промотора. Поэтому вcтройка чужДНК до сайту PstI будут инактивироваться оба селективных маркера: Sur и Smr. Напротив, втройка чужДНК по сайту BstEII маркеры не повреждает, что усложняет фенотипический отбор. Встройка чужДНК по сайту SstI приводит к инактивации гена устойчивости к стрептомицину aphC, но не нарушает ген устойчивости к сульфаниламидам sul (Sur). Маркер Sur сохраняется также при встройке по EcoRI, а ген aphC при такой встройке не экспрессируется. Оставшийся маркер sul имеет ограниченное применение, так как многие виды бактерий относительно нечувствительны к сульфаниламидам. Для преодоления этих трудностей на основе плазмиды RSF1010 был создан ряд векторов, среди них pKT231.

pKT231 имеет 2 маркера – Kmr и Smr. Этот вектор позволяет клонировать ДНК, втроенную по участкам узнавания рестриктаз HindIII, XhoI (Kms, Smr), EcoRI (Kmr, Sms) и нескольким другим.

На основе репликона RSF1010 были созданы также космиды, среди которых pMMB34. Космиды широкого круга хозяев применятся для создания клонотек бактериальных геномов с целью их дальнейшего изучения. В pMMB34 был встроен сайт cos фага лямбда для упаковки ДНК in vitro в капсиды фага лямбда.

Трансформация E. coli и последующие конъюгативный перенос (мобилизация) векторов в другие бактерии. Как известно, после лигазной реакции количество целевых гибридных молекул векторной ДНК невелико. Для введения этих молекул в бактерии необходима система с высокой эффективностью трансформации и отбора гибридных клонов. Наиболее подходят для этой цели клетки E. coli. Затем успешно трансформированные клоны E. coli используют для конъюгационного переноса векторов в практически любой вид грамотрицательной бактерии. Для этого плазмида-помощник (чаще группы IncP) должна находиться в той же клетке, в которую введена гибридная молекула ДНК (созданная на основе плазмиды IncQ). Коньюгационный перенос имеет преимущества перед трансформацией в том, что:

1) для многих видов бактерий на разработаны эффективные методы трансформации;

2) R-S системы многих бактерий значительно препятствуют трансформации их клеток двухцепочечной ДНК;

3) внехромосомную векторную ДНК не нужно выделять из клеток;

4) перенос мобилизируемых молекул происходит с высокой частотой (не менее каждой 10-й донорной клетки); переносится одна цепь ДНК, и поэтому она не повреждается R-S-системами.

Экспрессирующие векторы на основе плазмид группы IncQ. Примером является векторная плазмида pPLGN1, сконструированная на основе клонирующего вектора pKT240. В нем по сайту PvuII встроили кодирующая последовательность зрелой формы белка интерлейкина 2 человека (ген IL-2), и получили эксперессирующий вектор pPLGN1HIL2. Сначала этим вектором трансформировали клетки E. coli, а затем из гибридных клонов перенесли его путем конъюгации в бактерии родов Erwinia (E. chrysanthemi, E. carotovora) и Serratia (S. marcescens). Экспрессию целевого гена регулируют встроенный в данный вектор фаговый промотор pL. Активность же промотора регулируется репрессором cI857.