Определение количества клеток с помощью микроскопа.

Количеству клеток в единице объема - титр клеток (или фаговых частиц).Чтобы определить общее количество микроорганизмов в различных материалах, применяют методы прямого подсчета клеток под микроскопом (в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, намембранных фильтрах).

Подсчет клеток в окрашенных препаратах (метод Виноградского–Брида)Преимущество: фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются.Техника: а) на хорошо обезжиренном предметном стекле маркером рисуют прямоугольник строго известной площади (2, 4 или 6 см2), б) на стекло в прямоугольник микропипеткой (или автоматической

пипеткой) наносят определенный объем суспензии клеток (0,01; 0,02 или 0,03 мл), в) суспензию равномерно распределяют петлей по всей площади прямоугольника, г) препарат высушивают на воздухе и фиксируют 15 мин 96 % этанолом, д) проводят окрашивание фуксином Циля 1 – 2 мин,

е) краситель сливают, препарат промывают водой, последовательно погружая стекло в 5 – 6 стаканов с водой) и высушивают на воздухе.Количество клеток микроорганизмов подсчитывают, используя иммерсионный объектив, в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами.Для получения достоверных результатов клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать не менее чем в 50 – 100 полях зрения, а общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600.

М – количество кл-ок в 1 мл; А – среднее число кл-к в квадрате

окулярной сетки (поле зрения); s и S – площадь квадрата окулярной

сетки (поля зрения) и приготовленного мазка в мкм2 соответственно;

V – объем нанесенной на стекло суспензии в мл; n – разведение.

2. Подсчет клеток на мембранных фильтрах

Этот метод используют для подсчета количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате

фильтрации определенного объема исследуемой пробы с окрашиванием и подсчетом в микроскопе.

С помощью мембранного фильтрования могут быть подсчитаны как жизнеспособные клетки микроорганизмов, так и определено общее количество клеток. Техника: 1. Собирают прибор для фильтрования под вакуумом. Дляэтого основание стерильного фильтродержателя вставляют в стериль-

ную колбу Бунзена, с помощью стерильного пинцета помещают в фильтродержатель стерильный фильтр и закрепляют зажимом. Отводной конец колбы Бунзена соединяют с вакуумным насосом.

2. Строго определенный объем исследуемого материала пропускают через мембранный фильтр, создавая с помощью насоса вакуум. 3. Фильтр, с осевшими клетками микроорганизмов, снимают сте-

рильным пинцетом и исследую в зависимости от целей эксперимента.

Проводят окрашивание фильтра 5 % раствором эритрозина в 5 % растворе фенола. Для этого фильтр помещают нижней стороной в чашкуПетри на фильтровальную бумагу, насыщенную красителем, чашкузакрывают и оставляют на 30 – 60 мин. Фильтр отмывают от красителя, последовательно перенося его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, насыщенной дистиллированной водой до тех пор, пока он не перестанет окрашивать влажную фильтровальную бумагу. Фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для микроскопирования. На предметное стекло накапывают иммерсион-

ное масло и помещают на него окрашенный мембранный фильтр таким образом, чтобы клетки микроорганизмов были сверху. На поверхность фильтра наносят еще каплю иммерсионного масла и по-

крывают фильтр покровным стеклом.где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения); s и F – площадь квадрата окулярнойсетки (поля зрения) и мембранного фильтра в мм2, соответственно;V – объем профильтрованной суспензии в мл; 106 – коэффициент пе-ревода мм2 в мкм2.

При подсчете колоний для увеличения контрастности мембранный фильтр с колониями окрашивают. Для этого поверхность фильтра, находящегося в чашке Петри, заливают 0,01 % водным раствором окса-

лата малахитового, который через 8 – 10 с сливают. При этом способе окрашивания колонии выглядят белыми или желтыми на фоне зеленого фильтра.

Метод подсчета клеток на мембранных фильтрах с помощью люминесцентного микроскопа заключается в концентрировании бактерий из исследуемого материала на нелюминесцирующий мембранный фильтр, флюорохромировании акридиновым оранжевым и подсчете клеток в специальном (люминесцентном) микроскопе. Этот метод удобен тем, что позволяет непосредственно подсчитать как общее количество клеток, так и количество жизнеспособных клеток. При окрашивании акридиновыми красителями жизнеспособные клетки имеют зеленую, а нежизнесобные (мертвые) – красную окраску.