Механизм трансформации.

Процесс трансформации, начиная с момента добавления ДНК из клеток донорного штамма к культуре реципиента, в общих чертах включает следующие этапы, или стадии. 1. Адсорбцию донорной ДНК на поверхности реципиентной клетки. На этом этапе трансформирующий фактор чувствителен к ДНКазе.2. Поглощение донорной ДНК реципиентной клеткой. Причем ДНК может поглощаться только теми клетками, которые находятся в состоя- нии компетентности. На этой стадии ДНК уже нечувствительна к действию ДНКазы. 3. Образование в реципиентной клетке однонитевых фрагментов донорной ДНК. 4. Синапс одноцепочечной донорной ДНК с двухцепочечной хромосомой реципиента. 5. Интеграцию части донорной молекулы ДНК в реципиентную ДНК в результате рекомбинации. 6. Репликацию рекомбинантной молекулы ДНК. 7. Экспрессию генов, переданных от донора, т. е. образование трансформантов. Взаимодействие трансформирующей ДНК с компетентной клеткой бактерий начинается с адсорбции ДНК на поверхности клетки. Адсорбировать ДНК могут и некомпетентные клетки, однако с поверхности этих клеток она может быть легко удалена при отмывании и даже при разведении культуры. Такая адсорбция называется обратимой или неспецифической. У компетентных клеток образуется более прочная связь ДНК с клеточной поверхностью: для удаления или инактивации ДНК недостаточно простого отмывания, нужна обработка ДНКазой или антителами к ДНК. Необратимой или специфической.

При адсорбции у B. subtilis, пневмококков и других стрептококков молекулы трансформирующей ДНК прикрепляются к рецепторным участкам – белкам мембраны, причем ДНК адсорбируется одним концом в немногих точках, второй конец остается свободным. Такой способ взаимодействия определяет порядок вхождения ДНК в компетентные клетки, имеется определенная полярность ее проникновения.

Примерно через 30 с после начала адсорбции высокомолекулярная трансформирующая ДНК массой в несколько мегадальтон распадается на крупные двунитевые фрагменты массой около 1 МД каждый. ДНК еще чувствительна к ДНКазе, так как ее фрагменты находятся на клеточной поверхности.

За адсорбцией следует проникновение ДНК в клетку бактерий. В настоящее время наиболее популярна модель С. Лекса, объясняющая этот процесс. Согласно этой модели, проникновение ДНК у бактерий B. subtilis осуществляется путем активного транспорта с участием нуклеазы (или нуклеаз). Транспорт облегчается предварительным разрезанием молекулы адсорбированной ДНК на фрагменты меньшей длины. Кроме того, нуклеазы разрушают одну из цепей трансформирующей ДНК.

У гемофильных бактерий Haemophilus influenzae адсорбция и погло- щение трансформирующей ДНК осуществляется по-другому. По достижении в процессе роста культурой состояния компетентности на поверхности клеток появляются пузырьковидные выпячивания цитоплазматической мембраны диаметром 80–100 мкм, в количестве 5–13 на клетку. Эти пузырьки названы трансформосомами. Трансформосомы содержат на своей поверхности белок с молекулярной массой 25 кД. При участии

этого белка на них и происходит адсорбция ДНК.

Период между поглощением ДНК и включением ее в хромосому реципиента называется эклипс-фазой или фазой затмения. В эту фазу биологическая активность поглощенной ДНК резко падает, из реципиентных клеток нельзя выделить ДНК, обладающую трансформирующей активностью.

Однонитевая ДНК вступает в стадию синапса с гомологичным участком хромосомы реципиента. Донорную и реципиентную ДНК в этом комплексе удерживают водородные связи, ковалентного связывания не происходит. При тепловой денатурации этот комплекс распадается. Об- разующийся синапс приводит к интеграции однонитевой молекулы ДНК в хромосому. При этом наблюдается вытеснение соответствующей нити ДНК реципиента. Между флангами включенного фрагмента и ДНК реципиента образуются ковалентные связи; их уже невозможно разрушить в результате денатурации. Таким образом завершается процесс рекомбинации, в результате чего образуется гетеродуплексная структура (гибридная ДНК), в которой одна нить ДНК принадлежит донору, а другая – реципиенту.

После включения однонитевого фрагмента ДНК донора в хромосому реципиента может происходить явление коррекции. Оно сводится к выщеплению одной из нитей, принадлежащих донору или реципиенту, из двунитевого гибридного участка ДНК, и репаративному синтезу на месте образовавшейся бреши новой нити, полностью комплементарной нити матрице.