Для любой мутации, связанной с потерей генетической функции, требуются такие методы выявления, которые позволили бы идентифицировать очень редко возникающие мутантные клетки на большом фоне немутантных. В эту группу входят ауксотрофные мутанты, мутанты с изменениями в сбраживании углеводов, морфологические и другие условно-летальные мутанты.
Для получения ауксотрофных мутантов проводят следующее:
1 Клетки бактериального штамма выращивают до середины логарифмической стадии роста (5х108 кл/мл). Культуру отмывают от питательной среды путем центрифугирования (10 мин при 5000 об/мин) и ресуспендируют в цитратном буфере рН 6,0 с нитрозогуанидином в определенной концентрации. Используемую концентрацию мутагена подбирают экспериментально с таким расчетом, чтобы выживаемость культуры не была ниже 50 – 10 %.
2. Клетки отмывают от буферной смеси путем центрифугирования, ресуспендируют в жидкой полноценной среде и инкубируют 18 – 20 часов при оптимальной для роста бактерий температуре.
3. Выросшую культуру осаждают, отмывают минимальной средой (свободной от факторов роста) и культивируют при аэрации в течение 3 часов.
4. К полученной культуре добавляют пенициллин (конечная концентрация – 2000 мкг/мл) и продолжают инкубировать еще 2 часа. При использовании пенициллиновой методики необходимо строгое соблюдение некоторых условий:
• обрабатываемая пенициллином популяция бактерий не должна содержать более 107 кл/мл. При использовании более густой суспензии, выделяющиеся в среду продукты лизиса клеток, погибших от пенициллина, будут служить источником ростовых веществ для ауксотрофных мутантов. В результате ауксотрофные клетки начнут делиться и также будут погибать при действии пенициллина. В суспензиях клеток меньшей плотности содержание продуктов лизиса недостаточно для обеспечения роста ауксотрофов;
• обработка популяции бактерий пенициллином не должна быть продолжительной, так как увеличением времени воздействия антибиотика нарастает количество продуктов лизиса убитых клеток. Обычно используют высокие концентрации при продолжительности воздействия не более двух часов;
• бактерии, выращенные в полноценной среде, перед обработкой пенициллином необходимо отмыть после центрифугирования минимальной средой и выдержать в ней в течение времени, достаточного для 4 – 5 генераций. Это необходимо для истощения эндогенных метаболитов, имеющихся в ауксотрофных клетках, чтобы предотвратить их деление в среде с антибиотиком.
5. Из взвеси клеток готовят ряд последовательных разведений в ф зиологическом растворе и по 0,1 мл из каждого разведения высевают на полноценную агаризованную среду. Чашки инкубируют 24 – 48 ч.
6. Выросшие на чашках колонии пересевают методом реплик на агаризованные полноценные и минимальные среды. Инкубируют 24 – 48 ч.
7. Анализируют рост каждого клона на полноценной и минимальной среде. Клоны, которые сформировались только на полноценной, а не на минимальной среде, считают потомством мутантных клеток.
8. Определяют потребности в факторах роста у выделенных ауксотрофных мутантов. Для этого перепечатывают клоны на минимальный агар с добавками аминокислот в различных комбинациях Определяют, при наличии каких наборов факторов роста растет данный мутант. Эти данные дают возможность сделать вывод о природе нарушения, вызванного мутацией. Также для характеристики мутаций проводят определение природы изменений в ДНК с анализом, например, обратных мутаций. Частота реверсии – важный параметр, который является мерой генетической стабильности мутации. Критерием, определяющим ценность мутации является и степень инактивации гена, в котором произошла мутация (полная утрата или частичное сохранение функции).
Поможем написать любую работу на аналогичную тему