Компетентность. Получение компетентных культур.

Компетентностью при генетической трансформации обычно называется способность бактериальных клеток адсорбировать и поглощать чужеродную ДНК.

У многих видов бактерий компетентность возникает лишь на определенном этапе роста культуры. Например, культуры стафилококков находятся в стадии компетентности в ранней логарифмической фазе роста. Культуры бактерий Bacillus subtilis находятся в стадии компетентности на более поздних этапах экспоненциального роста, гемофильные бактерии – в стационарной фазе роста.

Состояние компетентности регулируется множеством генов (у бацилл их не менее 40), которые принято подразделять на ранние и поздние. К ранним относятся гены «настраивающие» (подготавливающие)

клетку на приобретение компетентности; к поздним – гены, детерминирующие механизмы связывания и поглощения ДНК, преобразования (или процессинга) ДНК по ходу поглощения; и наконец, гены, управляющие рекомбинацией трансформирующей ДНК с хромосомой реципиентной клетки.

В ряде научных лабораторий (Р. Пакула, Р. Хочкисс, Р. Томас и др.) было показано, что состояние компетентности у стрептококков можно передать от компетентных клеток некомпетентным. Передача состояния компетентности не требует физического контакта бактерий, потому что его можно индуцировать посредством фильтратов суспензий бактериальных культур. Было сделано заключение, что существует какой-то внеклеточный фактор, обеспечивающий состояние компетентности. В поведении феромонов компетентности бацилл и стрептококков есть общие особенности. Эти небольшие пептиды выходят из компетентных клеток в среду и индуцируют развитие компетентности, активируя все гены компетентности у почти всех клеток популяции стрептококков или части клеток бацилл. Восприятие клеткой феромонного сигнала осуществляется за счет двухкомпонентной передающей системы, состоящей из сенсорного белка и белка-регулятора ответа.

Сенсорный белок состоит из трансмембранного рецепторного домена, пронизывающего поверхностные слои клетки и соприкасающегося с внешней средой, и передающего модуля, находящегося в цитоплазме. Сенсорными белками часто служит семейство ферментов гистидинкиназ, обладающих способностью к фосфорилированию. Феромон контактиру-ет с рецептором, имеющим к нему сродство; сигнал идет к передающему модулю и от него – к второму компоненту этой системы, белку-регуля-

тору ответа. Передача сигнала происходит посредством фосфорилирования белка-регулятора с использованием остатков аминокислот гистидина и аспартата. Фосфорилированный регулятор взаимодействует с промотором того или иного оперона и активирует экспрессию ряда «молчащих»

до сих пор генов, отвечающих за компетентность. В результате метаболизм клетки меняется, иногда коренным образом. К этому и сводится ответ на феромонный сигнал, полученный рецептором.

Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются • обладают сниженным уровнем метаболизма; • более устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции; • сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием; • меньшими размерами, чем некомпетентные;

• изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны;

• повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой обработке; • сниженным поверхностным зарядом.

Однако существует много видов бактерий, у которых отсутствует естественная компетентность. Примером таких бактерий являются E. coli, бактерии рода Erwinia и другие, но несмотря на это, они также могут быть трансформированы. Для этого их клетки обрабатывают тем или иным способом, индуцируя у них способность к поглощению ДНК. Наибольшую известность приобрел метод индукции компетентности с помощью ионов кальция – кальциевый метод. Клетки бактерий выдерживают в присутствии ионов Са2+ (50 мМ) при 0 .С с последующим кратковременным тепловым воздействием при 37 .С или 42 .С. В этих условиях возникает общее состояние компетентности и появляется возможность осуществления хромосомной и плазмидной трансформации.

Эффективность трансформации повышается при совместном действии ионов Са2+ с ионами Mg2+, Mn2+ или Rb+. Кроме того, эффективность трансформации повышается при увеличении времени инкубирования с ионами Ca2+, а также при добавлении диметилсульфоксида.

Широко используется также способ индукции компетентности за счет глубокого замораживания с последующим оттаиванием клеток. При этом осуществляется трансформация как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Такой способ трансформации получил название криотрансформации. Чтобы получить трансформанты с помощью этого метода, смесь реципиентных клеток и ДНК донора в присутствии криопротектора (0,5 % раствора твина-80) замораживают (до –196 .С), а затем отогревают

при +42 .С и высевают на селективные среды, позволяющие отобрать трансформанты.

В последнее время трансформацию успешно осуществляют с помощью электропорации. Существуют специальные приборы – электропораторы, которые за счет кратковременного воздействия (обычно 5–

20 мс) электрического поля высокой напряженности (1–15 кВ/см) на клеточную мембрану приводят к образованию в ней пор (электропробой). Время существования и размер пор достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. Объем клетки при этом увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и клеток-реципиентов для каждой системы клеток подбирают экспериментально, для того чтобы до биться высокой частоты поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество образо-

ванных трансформантов может достигать 80 % выживших клеток.