Enterobacteriaceae

Международная классификация энтеробактерий застыла на уровне 60-х годов.

Поэтому теперь – по приказу – перешли на Берджи. Сейчас Берджи не выходит и все придерживаются американской классификации.

Pasterella X  после 70-х годов =Y. enterocolitica, и теперь она не неподвижная, а слабодвигающаяся.

Plesiomonas перевели в энтеробактерии, хотя они и оксидазоположительные (вызывают дезинтериеподобные заболевания, стул с кровью, длительные кровавые поносы) Передается через воду.

Минимальный ряд:

По 36 тестам обязательно определим культуру.

Для определения семейства достаточно 3-х тестов: оксидаза, Хью-Лейфсон, редукция нитратов в нитриты.

Грамотрицательные, факультативно-анаэробные палочки, по жгутикам – перитрихи, спор нет, оксидазаотрицательны (кроме Plesiomonas)

Оксидаза=цитохромоксидаза – 2 фермента, действие которых связано друг с другом. Существует, как правило, у аэробов, у анаэробов оксидазы, как правило, нет. Факультативные анаэробы могут иметь (Vibrio, Pasterella) или нет.

У энтеробактерий задействован другой фермент (нитратаза), поэтому они могут расти аэробно.

Аэробные микроорганизмы обязательно имеют оксидазу и пероксидазу (каталазу).

Строгие анаэробы оксидазы не имеют, но и не растут (не живут) при наличии кислорода воздуха.

Метод Эрлиха: 1% водный раствор диметилпарафенилдиамина + 1 капля 1% спиртового раствора α-нафтола.

Метод Ковача – более чувствителен. 1% водный раствор тетраметилпарафенилендиамина. Через несколько (до 20-30’) секунд ярко-красное окрашивание.

На КА оксидазу не определяют (даже сняв колонию со среды – ложноположительный результат), т.к. эритроциты содержат оксидазу.

Не брать культуру со среды с углеводами (любыми, но в первую очередь – с глюкозой) – можно получить ложноотрицательный результат, т.к. на среде с углеводом работают только углеводные ферменты, а остальные – «приглушены».

Все (за редким исключением) восстанавливают нитраты в нитриты

(кстати больше всего нитратов накапливается в свекле)

У энтеробактерий NO2  далее до  H3N, NO, N2↑

В нитратном бульоне нет никаких органических веществ и чтобы микробы начали «есть» неорганические соли нужно время, поэтому смотрится через 4 суток – кажется реактив Грисса – краснеет, но если большая посевная доза или очень активная культура, то через 4 суток можно получить ложноотрицательный результат (промежуточный продукт – NO2 – мог уже израсходоваться). Поэтому в нитратный бульон – поплавки для улавливания газообразования (азота); если результат отрицательный, но в поплавке газ, то это, скорее всего, положительный результат (N2↑), т.к. CO2↑ в принципе не мог образоваться в этой среде.

По Кауфману – добавляют цинковую пыль (в случае истинного отрицательного ответа он краснеет, т.к. связывается с NO3 и даёт красное вещество. Значит реакция не пошла).

O/F тест Лейфсона. Энтеробактерии – изменения в обеих пробирках.

Сначала: углевод → ПВК → далее пути различаются.

Окисление идёт с образованием меньшего кол-ва кислых продуктов.

В анаэробных условиях образуются уксусная, молочная кислоты, CO2↑.

Через 24 часа и в анаэробных и в аэробных условиях видна кислая реакция.

Среды типа Ресселя, Клиглера и т.п.

Столбик – анаэробные условия. Косяк – аэробные условия.

Работа среды основана на том, что в анаэробных условиях образуется больше кислоты и кислый рН держится дольше.

Через 8-10 часов весь Рессель кислый, а затем уже происходит дифференциация цвета (через 18-24 часа).

Кислота в аэробных условиях из глюкозы уходит и если она есть – это уже от лактозы.

Через 20 часов в косячке углеводы уже съедены и идёт утилизация пептона и поэтому рН нейтральная или защелачивается.

Из-за различной ферментативной активности могут быть и разные результаты на Ресселе и пестром ряде Гисса. Поэтому Рессель – ориентировочный, не требует перепроверки только сероводород.

Определение с ацетатом свинца запрещены уже лет 20.

Сейчас определяем тиосульфатредуктазу (расщепление тиосульфата натрия с образованием H2S↑). Индикатор – соли железа. В кислых условиях сульфид железа (чёрный цвет) образуется быстрее, поэтому обычно чернеет столбик.

Правила посева для получения однозначного результата.

Нужен массивный посев – полной петлёй

Edwardsiella через сутки очень плохо растёт на комбинированных средах и можно не увидеть почернения – оставляем на 2 суток.

Shigella dysenteria каталазаотрицательна и вообще растёт плохо на средах.

ВБИ-штаммы Escherichia, Salmonella дают очень чахлый рост, т.к. устойчивы к антибиотикам и дезинфектантам и на это уходит большой энергетический запас.

Все энтеробактерии очень легко теряют свою подвижность. Определение с ТТХ или без него – всё равно видно.

Пёстрый ряд – углеводы – источник энергии.

Глюкоза, сахароза, лактоза – обязательно повторить вне зависимости от результатов на средах типа Реселя-Клиглера.

При необходимости – мальтозу и ксилозу

Трисахарид – раффиноза

Полисахариды – инулин (из фруктозы), крахмал (из глюкозы)

Многоатомные спирты – маннит, сорбит

Салицин – дисахарид

Углеводы смотреть через 48 часов максимум.

Если положительная реакция получена через сутки – уже можно сбросить.

Через 2-е суток – сбросить всё – все энтеробактерии образуют мутантов и обязательно кто-нибудь этот углевод утилизирует

Мочевина – под воздействием аминогидролазы мочевины (уреазы) даёт 2H3N с сильным подщелачиванием.

Посев делать массивным, условия аэробные.

По Преусу периодически встряхивать жидкую среду для насыщения кислородом.

Результаты снимать через 48 часов – окончательный отрицательный результат.

Proteus уже через 6-8 часов даёт положительную реакцию.

Уреаза лучше всего работает на щелочной среде.

2 пробирки со средой Кларка – MR и VP – реакции.

Глюкоза → ПВК → а далее большое количество кислот (молочная, муравьиная, янтарная и др.)

Муравьиная кислота и даёт MR+ реакцию, т.к расщепляется с большим количеством CO2 и H2 в одинаковой пропорции (CO2 /H2=1), что даёт кислую рН.

MR- у тех энтеробактерий, которые не имеют фермента, отделяющего H2 от муравьиной кислоты (CO2 /H2=2-3), устанавливается щелочная рН.

Сеется массивно, окончательный результат – через 48 часов.

VP-реакция – определение ацетоина (ацетилметилкарбинола) – продукта глюкозного обмена с образованием ряда кислот и уксусной кислоты → уксусный альдегид → ацетоин ↔ 2,3-бутандиол.

Определяется в присутствии О2 и щелочи. Катализатор – α-нафтол. Сначала добавляем - α-нафтол, затем КОН. На 5 мл культуры 3 мл α-нафтола и 1 мл 40% КОН. Иначе можно получить ложноотрицательный либо слабоположительный результат. Если больше КОН – маскировка слабовыраженной окраски. Результат смотреть в течение 1 часа, затем сбросить.

Белковый обмен

Индол – при расщеплении пептонов образуется индоламинопропионовая кислота (триптофан) – это и есть источник индола.

Энтеробактерии, которые имеют несколько ферментов, называемых вместе триптофаназа – от триптофана отщепляется группа аланина и освобождается индол.

Кислый рН тормозит образование индола – поэтому нет смысла вставлять бумажку на индол в пробирки с сахарами, а надо в 2% пептонной воде. Посев средний, не массивный, окончательный результат через 48 часов.

Лизиндекарбоксилаза. Лизин → кадаверин.

Орнитиндекарбоксилаза. Орнитин → путресцин.

С образованием большого количества СО2 и среда сильно подщелачивается.

Посев ставится на 4 суток, т.т. эти ферменты идут по индуцибельному типу. Сеется очень небольшой дозой.

Фенилаланин→фенил-ПВК→ с FeCl2 зелёную окраску. Смотрят 5 минут.

Соли органических кислот: цитратные и ацетатные.

Цитрат Симмонса, среда Кристенсена. Если не растёт на Симмонса, может расти на Кристенсена. Цитрат Симмонса – очень жесткая среда.

Ацетатная среда – соли уксусной кислоты как источник углерода.

Дифференциация Eschirichia и Salmonella. Сеять минимальной посевной дозой. Считать через 2-е суток.

β-галактозидаза, ОНПГ, OVPO. Превращается в нитрофенол желтого цвета. Фермент индуцибельного типа. Посев массивный, результат через 48 часов.

Краткая характеристика родов

Edwardsiella и Erwinia плохо растут на наших средах и их вряд ли выделим.

Eschirichia 6 видов. E.blattae – кишечник черного таракана. Остальные – УПМФ при некишечной этиологии.

Shigella – уже можно встретить группы A-D соответственно видам.

Salmonella

Citrobacter – из различного патологического материала кроме C. Rodentium – от грызунов.

Раньше считали – много Citrobacter – виновник ОКИ. C. frendii от человека с тяжелым поносом и из образцов говядины – шигоподобный токсин (впервые).

Providencia alcalifaciens – может вызвать понос только у грудных младенцев.

Сейчас считают, что Citrobacter не вызывают ОКИ, для этого штамм должен обладать специальным геном-плазмидой.

Вспышки, связанные с говядиной – обычно O157:H7 – сеть «МакДональдс», непрожаривание котлет.

Klebsiella

Raoultella ornitinolitica – капсулы, ВБИ, выделена при сепсисе из крови. Также тяжёлый гастроэнтерит у пожилой ослабленной.

Raoultella planticola – у человека болезней не вызывает. Оптимум роста – 22 ºС.

Raoultella terrigena – то же.

Но появились статьи о случаях тяжёлого панкреатита, вызванного R. planticola (2 случая)

У одного после замены митрального клапана→пневмония→сепсис

Другой – алкоголик, понос, тяжёлые боли в животе →абсцесс панкреаса.

Enterobacter

E.sakazaki – 1983-1985 гг в Англии 1-2-3 дневные младенцы, менингит, многие погибли. По биохимии – E.cloacae, но давал жёлтый пигмент. Выделен из СМЖ и кишечника. В окружении найти не смогли – ни у врачей, ни у родителей. Экологическая ниша: коровы→молоко→детское питание. По стандарту детское питание проходило (малое количество коли-формов)

Hafnia – раньше считали возбудителем ОКИ.

H.alvei биогр 1 – не встречается у человека.

H.alvei – фекалии, сепсис, СМЖ, (при гастроэнтеритах нет чёткой уверенности у 9-ти месячного ребенка и турист в Финляндии – имели факторы патогенности). У здоровых тогда Hafnia не выделена.

Morganella morganii – различный материал, в т.ч. моча. В фекалиях – резидентная микрофлора. Про диареи – нет данных

Proteus – все 5 роящиеся.

P. myxofaciens роится при комнатной температуре и не переносит 37ºС .

P. penneri различный патологический материал, даже кератиты.

Providencia alcalifaciens

P. stuartii – ВБИ, раны, мочевыводящий тракт

P. rettgeri – в основном мочевыводящий тракт

P. rustiglanii – различный патологический материал кроме поносов

P. heimbachae – аборт у пингвинов и коров. У человека нет.

Serratia marcescens – преобладает при патологиях в 80% среди других серраций

Все серрации арабинозапозитивны кроме S. marcescens

S. liquefaciens – первенство в Англии

S. odorifera – неприятный запах, сепсис

S. ficaria – выделен из кала, непатогенен, инжир

S. entomophila – у человека нет

S. fonticola – у человека редко, в основном из воды

Edwardsiella tarda – присоединяется к другим ОКИ (вирусных, глистных). По последним публикациям может вызывать ОКИ. В Таинланде центр по эдвардсиеллам. Там и в Японии – факультативный представитель микрофлоры человека.

E. hoshinae – в основном птицы и вода. У человека очень редко, очевидно из воды.

E.ictaluri – у человека нет.

Yersinia

3 – тяжелые заболевания

4 – не вызывает ОКИ

5 – кровь, моча, ОКИ

6 – поносы не вызывает, сепсис, мочевой тракт

7 – у человека пока нет, вода и рыбы, почва

8 - у человека пока нет, вода и рыбы, почва

9 – грызуны, у собак и может заражать хозяина

10 – у человека пока нет (только в фекалиях как факультативный представитель)

11 – болезнь красного рта у рыб (форель), холецистит у человека, возможно другой патологический материал.

Obesumbacterium proteus – бывшие Flavobacterium. Плохо растут при 37 ºС.

Xenorhabdus luminescens – из крови

Kluyvera – чаще ascorbata (мокрота, моча, сепсис). В кале – не ОКИ

K.cryocrescens у человека редко

Tatumella в международном банке данных выделялась только у человека, в окружающей среде не найдены.

94-95% - патология дыхательных путей. Ещё – сепсис.

Trabulsiella ОКИ под вопросом. В основном в окружающей среде

Yokenella ранее Koserella. Фекалии, раны, мокрота. Очень мелкие по размеру. При укусах насекомых.

Moelerella – фекалии. ОКИ под вопросом.

Pragia – вода, у человека нет

Budvicia – из воды, у человека нет

Buttiauxella noackiae – Только она. Очень редко у человека.

Cedecea neteri –в основном дыхательные пути

Ewingella дыхательные пути, мокрота, раны, сепсис

Leclercia частично Enterobacter agglomerans и Escherichia adecarboxylata. Образует жёлтый пигмент. Свойства как у эшерихий, кроме поносов. Сепсис, дыхательные пути. Широко – в окружающей среде.

Plesiomonas дизентериеподобные ОКИ, иногда очень тяжёлые. Источник – вода. В основном в тёплых регионах

Erwinia и Enterobacter

Calynaetobacterium – ранее входил в Klebsiella, предаётся половым путём, широко распространена в промышленных странах.

Escherichia coli

-   МУ по серотипированию бактерий E.coli по Н-антигену упрощенным ускоренным способом Утв. 21.02.1985 Ю. Фатинер, А.Ершов.

-   Приказ МЗ СССР №475 от 16.08.1989 О мерах по дальнейшему совершенствовании профилактики заболеваний ОКИ в стране (вместо пр №840 от 1976 г.)

-   Приказ МЗ СССР №445 от 20.09.1958 О дополнительных мероприятиях по снижению ОКЗ у детей раннего возраста

-   МР Выявление гемолитических, адгезивных, энтеротоксигенных энтеробактерий М.1987 МР №28-6/7

-   Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli О157:Н7 (МУ М.2001 г. МЗ РФ)

Уропатогенные эшерихии – это не те, которые являются патогенными при  ОКИ

С 1983-1985 гг. в мире перестали говорить о К-антигене у эшерихий. Обязательно определяем О-антиген, затем Н-антиген (эту работу начал ещё Кауфманн)

Сильно подкисляют среду и переходят в R-формы и погибают (собственные могильщики).

Для всех энтеробактерий рНoptim=7

Антигенная структура

164 О-серогруппы (по литературе сейчас более 170)

57 Н-антигенов

Во всём мире обязательно выдаётся ответ с указанием О- и Н-антигена.

К-антиген (капсульный), не разрушается кипячением. Этого антигена у эшерихий нет. То что считалось К-антигеном у эшерихий – это цепочки поверхностного О –антигена. В мире этот термин не употребляется.

Кауфман просил присылать серовары с описанием клиники.

У нас подобную работу проводила Новгородская. Её в первую очередь беспокоили детские поносы.

Середина ХХ века – ЭПКП=EPEC по международной классификации

По типу гастроэнтерита, напоминая сальмонеллёз и имеет перекрестные серологические реакции с сальмонеллами.

Прикрепляется к эпителию кишечника как и сальмонелла.

В мире EPEC считаются возбудителями детских (малыши до 1 года) поносов.

У взрослых – другие.

В США регулярно выпускают таблицы и там EPEC наименьшее кол-во. Считают, что они распространены в основном в развивающихся странах

В ОКА-сыворотку входят в основном ЭПКП-серовары.

Новгородская назвала эту группу ЭПКП1

ЭПКП2 группу сейчас называют ЭИКП=EIEC

Прикрепляются к клеткам эпителия толстого кишечника и проникают между клетками, как Shigella. «Дизентериеподобные» - даже становятся неподвижными.

ЭТКП=ETEC холероподобные ОКИ

ЭГКП=EHEC=STEC=VTEC

В 1982 г на сцене появилась О157:Н7

Высокий процент летальности, тяжелая клиника

2 вида токсинов:

шигатоксин I – полностью идентичен токсину Шига

шигатоксин II – идентичен токсину Шига на 60%

Острая боль, водянистая дирея→кровянистая диарея с алой кровью. У некоторых рвота. У О104 подобная клиническая картина. Восходящий отдел тонкого кишечника. У некоторых – уремический гемолитических синдром и при присоединении уремического синдрома часто летальный исход. Заражение через говядину (гамбургеры). О157:Н7 часто находят в кишечнике коров.

Потом выяснили, что шигаподобный токсин встречается у очень многих E. coli.

Если картина дизентерии, но Shigella не выделяется, а E. coli идёт в большом количестве, проверьте её на сорбит (–)

орнитин(+) лизин(+)

Тогда надо быстрее определять чувствительность к антибиотикам.

О157:Н7 может идти из молока и молочных продуктов так как было в Тульской и Кемеровской областях

У О104:Н4, О104:Н10(11), О104Н- есть и шигатоксин и веротоксин

Сейчас только появилась ЭАгЭК=EAggEC=DAEC энтероаггрегативная E. coli, диффузноаггрегативная E. coli

На культуре ткани образуют диффузные скопления, прикрепляясь к клеткам ткани. Эти E. coli могут иметь цитотоксин, который вызывает диарею у детей. У взрослых – только с иммунодефицитолм.

Развивающиеся страны: Кения, Индия, Чили, Мексика, Япония.

Дети от 1 года до 5 лет. Не было случаев чтобы заболел младенец до 1 года или взрослый без иммунодефицита.

Как правило диарея с кровью, но может быть и без крови.

О клинике, эпидемиологии и патогенезе мало известно.

Лабораторная диагностика:

Обычно сыворотки применяют после биохимического установления рода и вида.

Берём 5 колоний. Сначала – поливалентная. Затем – адсорбированная, если нет адсорбированной – используют сыворотку для линейной реакции агглютинации (пробирочному ряду).

70% физраствора и 30% чистого медицинского глицерина. Этой смесью смываем культуру и прогреваем 1 час (кипячением)

Густоту взвеси делать ≥ 4 млрд

Получасовое кипячение приводит к гипердиагностике О144

На предметном стекле большую каплю сыворотки соединить с большой каплей взвеси (адсорбированная сыворотка очищается на ионообменных смолах и, проходя через сефадекс сыворотка становится концентрированной и в подсыхающей капле по краям выпадают кристаллы полисахаридов, что похоже на агглютинацию).

Через 15 минут смотрим наличие агглютинации

Раньше патогенность – это способность вызывать заболевание. Сейчас – патогенность это характеристика генотипа, т.е. она заложена в генетическом аппарате и контролируется генами.

У Shigella и Salmonella – гены в хромосомах. А у УПМФ – внехромосомные гены (плазмиды)

Микроб пока не прикрепился, размножаться не будет.

Т.Е. для патогенности должны иметься 2 фактора: Адгезивность и токсин-или-инвазивность-или-гемолизин

Гемолизин энтеробактерий придаёт им высокую стабильность в организме.

Без определения этих факторов говорить о патогенности E. coli НЕЛЬЗЯ!!!

Нет ни одного серовара, который бы в 100% имел все факторы патогенности при выделении при ОКИ.

Например О111 – 80% имели факторы, О127-50%.

Т.е. мы можем выдать только «Выделена E. coli, серовар О000:Н00»

«не выделены E. coli, входящие в поливалентную сыворотку »

Потенциально патогенными бактериями можно заниматься только по назначению клиницистов.

А патогенные среди энтеробактерий только Shigella и некоторые Salmonella. Эшерихии – УПМФ!!!.

SHIGELLA

В глицериновом консерванте Shigella сохраняется до 10 суток (через 10 суток остаётся 40%, а на среде Кэрри-Блэр уже через сутки остаётся 40%)

SALMONELLA

-   МУ 2008 Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов А,В и С. Утвеждены Онищенко.

-   МУ 2010 Лабораторная диагностика сальмонеллёзов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды. Введены взамен МУ 1990 г. Лабораторная диагностика сальмонеллёзов человека и животных, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах, кормах и объектах окружающей среды

В последней схеме Кауфмана сальмонеллы одного серовара, но различающиеся по биохимии, объединены.

S.paratyphi B и др. объединены с S.java

Группы Е1 объединена с Е2 и Е3