Enterobacteriaceae

Международная классификация энтеробактерий застыла на уровне 60-х годов.

Поэтому теперь – по приказу – перешли на Берджи. Сейчас Берджи не выходит и все придерживаются американской классификации.

Pasterella X  после 70-х годов =Y. enterocolitica, и теперь она не неподвижная, а слабодвигающаяся.

Plesiomonas перевели в энтеробактерии, хотя они и оксидазоположительные (вызывают дезинтериеподобные заболевания, стул с кровью, длительные кровавые поносы) Передается через воду.

Минимальный ряд:

По 36 тестам обязательно определим культуру.

Для определения семейства достаточно 3-х тестов: оксидаза, Хью-Лейфсон, редукция нитратов в нитриты.

Грамотрицательные, факультативно-анаэробные палочки, по жгутикам – перитрихи, спор нет, оксидазаотрицательны (кроме Plesiomonas)

Оксидаза=цитохромоксидаза – 2 фермента, действие которых связано друг с другом. Существует, как правило, у аэробов, у анаэробов оксидазы, как правило, нет. Факультативные анаэробы могут иметь (Vibrio, Pasterella) или нет.

У энтеробактерий задействован другой фермент (нитратаза), поэтому они могут расти аэробно.

Аэробные микроорганизмы обязательно имеют оксидазу и пероксидазу (каталазу).

Строгие анаэробы оксидазы не имеют, но и не растут (не живут) при наличии кислорода воздуха.

Метод Эрлиха: 1% водный раствор диметилпарафенилдиамина + 1 капля 1% спиртового раствора α-нафтола.

Метод Ковача – более чувствителен. 1% водный раствор тетраметилпарафенилендиамина. Через несколько (до 20-30’) секунд ярко-красное окрашивание.

На КА оксидазу не определяют (даже сняв колонию со среды – ложноположительный результат), т.к. эритроциты содержат оксидазу.

Не брать культуру со среды с углеводами (любыми, но в первую очередь – с глюкозой) – можно получить ложноотрицательный результат, т.к. на среде с углеводом работают только углеводные ферменты, а остальные – «приглушены».

Все (за редким исключением) восстанавливают нитраты в нитриты

(кстати больше всего нитратов накапливается в свекле)

У энтеробактерий NO2  далее до  H3N, NO, N2↑

В нитратном бульоне нет никаких органических веществ и чтобы микробы начали «есть» неорганические соли нужно время, поэтому смотрится через 4 суток – кажется реактив Грисса – краснеет, но если большая посевная доза или очень активная культура, то через 4 суток можно получить ложноотрицательный результат (промежуточный продукт – NO2 – мог уже израсходоваться). Поэтому в нитратный бульон – поплавки для улавливания газообразования (азота); если результат отрицательный, но в поплавке газ, то это, скорее всего, положительный результат (N2↑), т.к. CO2↑ в принципе не мог образоваться в этой среде.

По Кауфману – добавляют цинковую пыль (в случае истинного отрицательного ответа он краснеет, т.к. связывается с NO3 и даёт красное вещество. Значит реакция не пошла).

	Красный цвет	Нет окраски
Реактив Грисса	+	–
Металлический цинк	–	+

O/F тест Лейфсона. Энтеробактерии – изменения в обеих пробирках.

Сначала: углевод → ПВК → далее пути различаются.

Окисление идёт с образованием меньшего кол-ва кислых продуктов.

В анаэробных условиях образуются уксусная, молочная кислоты, CO2↑.

Через 24 часа и в анаэробных и в аэробных условиях видна кислая реакция.

Среды типа Ресселя, Клиглера и т.п.

Столбик – анаэробные условия. Косяк – аэробные условия.

Работа среды основана на том, что в анаэробных условиях образуется больше кислоты и кислый рН держится дольше.

Через 8-10 часов весь Рессель кислый, а затем уже происходит дифференциация цвета (через 18-24 часа).

Кислота в аэробных условиях из глюкозы уходит и если она есть – это уже от лактозы.

Через 20 часов в косячке углеводы уже съедены и идёт утилизация пептона и поэтому рН нейтральная или защелачивается.

Из-за различной ферментативной активности могут быть и разные результаты на Ресселе и пестром ряде Гисса. Поэтому Рессель – ориентировочный, не требует перепроверки только сероводород.

Определение с ацетатом свинца запрещены уже лет 20.

Сейчас определяем тиосульфатредуктазу (расщепление тиосульфата натрия с образованием H2S↑). Индикатор – соли железа. В кислых условиях сульфид железа (чёрный цвет) образуется быстрее, поэтому обычно чернеет столбик.

Правила посева для получения однозначного результата.

Нужен массивный посев – полной петлёй

Edwardsiella через сутки очень плохо растёт на комбинированных средах и можно не увидеть почернения – оставляем на 2 суток.

Shigella dysenteria каталазаотрицательна и вообще растёт плохо на средах.

ВБИ-штаммы Escherichia, Salmonella дают очень чахлый рост, т.к. устойчивы к антибиотикам и дезинфектантам и на это уходит большой энергетический запас.

Все энтеробактерии очень легко теряют свою подвижность. Определение с ТТХ или без него – всё равно видно.

Пёстрый ряд – углеводы – источник энергии.

Глюкоза, сахароза, лактоза – обязательно повторить вне зависимости от результатов на средах типа Реселя-Клиглера.

При необходимости – мальтозу и ксилозу

Трисахарид – раффиноза

Полисахариды – инулин (из фруктозы), крахмал (из глюкозы)

Многоатомные спирты – маннит, сорбит

Салицин – дисахарид

Углеводы смотреть через 48 часов максимум.

Если положительная реакция получена через сутки – уже можно сбросить.

Через 2-е суток – сбросить всё – все энтеробактерии образуют мутантов и обязательно кто-нибудь этот углевод утилизирует

Мочевина – под воздействием аминогидролазы мочевины (уреазы) даёт 2H3N с сильным подщелачиванием.

Посев делать массивным, условия аэробные.

По Преусу периодически встряхивать жидкую среду для насыщения кислородом.

Результаты снимать через 48 часов – окончательный отрицательный результат.

Proteus уже через 6-8 часов даёт положительную реакцию.

Уреаза лучше всего работает на щелочной среде.

2 пробирки со средой Кларка – MR и VP – реакции.

Глюкоза → ПВК → а далее большое количество кислот (молочная, муравьиная, янтарная и др.)

Муравьиная кислота и даёт MR+ реакцию, т.к расщепляется с большим количеством CO2 и H2 в одинаковой пропорции (CO2 /H2=1), что даёт кислую рН.

MR- у тех энтеробактерий, которые не имеют фермента, отделяющего H2 от муравьиной кислоты (CO2 /H2=2-3), устанавливается щелочная рН.

Сеется массивно, окончательный результат – через 48 часов.

VP-реакция – определение ацетоина (ацетилметилкарбинола) – продукта глюкозного обмена с образованием ряда кислот и уксусной кислоты → уксусный альдегид → ацетоин ↔ 2,3-бутандиол.

Определяется в присутствии О2 и щелочи. Катализатор – α-нафтол. Сначала добавляем - α-нафтол, затем КОН. На 5 мл культуры 3 мл α-нафтола и 1 мл 40% КОН. Иначе можно получить ложноотрицательный либо слабоположительный результат. Если больше КОН – маскировка слабовыраженной окраски. Результат смотреть в течение 1 часа, затем сбросить.

Белковый обмен

Индол – при расщеплении пептонов образуется индоламинопропионовая кислота (триптофан) – это и есть источник индола.

Энтеробактерии, которые имеют несколько ферментов, называемых вместе триптофаназа – от триптофана отщепляется группа аланина и освобождается индол.

Кислый рН тормозит образование индола – поэтому нет смысла вставлять бумажку на индол в пробирки с сахарами, а надо в 2% пептонной воде. Посев средний, не массивный, окончательный результат через 48 часов.

Лизиндекарбоксилаза. Лизин → кадаверин.

Орнитиндекарбоксилаза. Орнитин → путресцин.

С образованием большого количества СО2 и среда сильно подщелачивается.

Посев ставится на 4 суток, т.т. эти ферменты идут по индуцибельному типу. Сеется очень небольшой дозой.

Фенилаланин→фенил-ПВК→ с FeCl2 зелёную окраску. Смотрят 5 минут.

Соли органических кислот: цитратные и ацетатные.

Цитрат Симмонса, среда Кристенсена. Если не растёт на Симмонса, может расти на Кристенсена. Цитрат Симмонса – очень жесткая среда.

Ацетатная среда – соли уксусной кислоты как источник углерода.

Дифференциация Eschirichia и Salmonella. Сеять минимальной посевной дозой. Считать через 2-е суток.

β-галактозидаза, ОНПГ, OVPO. Превращается в нитрофенол желтого цвета. Фермент индуцибельного типа. Посев массивный, результат через 48 часов.

Краткая характеристика родов

Edwardsiella и Erwinia плохо растут на наших средах и их вряд ли выделим.

Eschirichia 6 видов. E.blattae – кишечник черного таракана. Остальные – УПМФ при некишечной этиологии.

Shigella – уже можно встретить группы A-D соответственно видам.

Salmonella

Citrobacter – из различного патологического материала кроме C. Rodentium – от грызунов.

Раньше считали – много Citrobacter – виновник ОКИ. C. frendii от человека с тяжелым поносом и из образцов говядины – шигоподобный токсин (впервые).

Providencia alcalifaciens – может вызвать понос только у грудных младенцев.

Сейчас считают, что Citrobacter не вызывают ОКИ, для этого штамм должен обладать специальным геном-плазмидой.

Вспышки, связанные с говядиной – обычно O157:H7 – сеть «МакДональдс», непрожаривание котлет.

Klebsiella

Raoultella ornitinolitica – капсулы, ВБИ, выделена при сепсисе из крови. Также тяжёлый гастроэнтерит у пожилой ослабленной.

Raoultella planticola – у человека болезней не вызывает. Оптимум роста – 22 ºС.

Raoultella terrigena – то же.

Но появились статьи о случаях тяжёлого панкреатита, вызванного R. planticola (2 случая)

У одного после замены митрального клапана→пневмония→сепсис

Другой – алкоголик, понос, тяжёлые боли в животе →абсцесс панкреаса.

Enterobacter

E.sakazaki – 1983-1985 гг в Англии 1-2-3 дневные младенцы, менингит, многие погибли. По биохимии – E.cloacae, но давал жёлтый пигмент. Выделен из СМЖ и кишечника. В окружении найти не смогли – ни у врачей, ни у родителей. Экологическая ниша: коровы→молоко→детское питание. По стандарту детское питание проходило (малое количество коли-формов)

Hafnia – раньше считали возбудителем ОКИ.

H.alvei биогр 1 – не встречается у человека.

H.alvei – фекалии, сепсис, СМЖ, (при гастроэнтеритах нет чёткой уверенности у 9-ти месячного ребенка и турист в Финляндии – имели факторы патогенности). У здоровых тогда Hafnia не выделена.

Morganella morganii – различный материал, в т.ч. моча. В фекалиях – резидентная микрофлора. Про диареи – нет данных

Proteus – все 5 роящиеся.

P. myxofaciens роится при комнатной температуре и не переносит 37ºС .

P. penneri различный патологический материал, даже кератиты.

Providencia alcalifaciens

P. stuartii – ВБИ, раны, мочевыводящий тракт

P. rettgeri – в основном мочевыводящий тракт

P. rustiglanii – различный патологический материал кроме поносов

P. heimbachae – аборт у пингвинов и коров. У человека нет.

Serratia marcescens – преобладает при патологиях в 80% среди других серраций

Все серрации арабинозапозитивны кроме S. marcescens

S. liquefaciens – первенство в Англии

S. odorifera – неприятный запах, сепсис

S. ficaria – выделен из кала, непатогенен, инжир

S. entomophila – у человека нет

S. fonticola – у человека редко, в основном из воды

Edwardsiella tarda – присоединяется к другим ОКИ (вирусных, глистных). По последним публикациям может вызывать ОКИ. В Таинланде центр по эдвардсиеллам. Там и в Японии – факультативный представитель микрофлоры человека.

E. hoshinae – в основном птицы и вода. У человека очень редко, очевидно из воды.

E.ictaluri – у человека нет.

Yersinia

3 – тяжелые заболевания

4 – не вызывает ОКИ

5 – кровь, моча, ОКИ

6 – поносы не вызывает, сепсис, мочевой тракт

7 – у человека пока нет, вода и рыбы, почва

8 - у человека пока нет, вода и рыбы, почва

9 – грызуны, у собак и может заражать хозяина

10 – у человека пока нет (только в фекалиях как факультативный представитель)

11 – болезнь красного рта у рыб (форель), холецистит у человека, возможно другой патологический материал.

Obesumbacterium proteus – бывшие Flavobacterium. Плохо растут при 37 ºС.

Xenorhabdus luminescens – из крови

Kluyvera – чаще ascorbata (мокрота, моча, сепсис). В кале – не ОКИ

K.cryocrescens у человека редко

Tatumella в международном банке данных выделялась только у человека, в окружающей среде не найдены.

94-95% - патология дыхательных путей. Ещё – сепсис.

Trabulsiella ОКИ под вопросом. В основном в окружающей среде

Yokenella ранее Koserella. Фекалии, раны, мокрота. Очень мелкие по размеру. При укусах насекомых.

Moelerella – фекалии. ОКИ под вопросом.

Pragia – вода, у человека нет

Budvicia – из воды, у человека нет

Buttiauxella noackiae – Только она. Очень редко у человека.

Cedecea neteri –в основном дыхательные пути

Ewingella дыхательные пути, мокрота, раны, сепсис

Leclercia частично Enterobacter agglomerans и Escherichia adecarboxylata. Образует жёлтый пигмент. Свойства как у эшерихий, кроме поносов. Сепсис, дыхательные пути. Широко – в окружающей среде.

Plesiomonas дизентериеподобные ОКИ, иногда очень тяжёлые. Источник – вода. В основном в тёплых регионах

Erwinia и Enterobacter

Calynaetobacterium – ранее входил в Klebsiella, предаётся половым путём, широко распространена в промышленных странах.

Escherichia coli

-   МУ по серотипированию бактерий E.coli по Н-антигену упрощенным ускоренным способом Утв. 21.02.1985 Ю. Фатинер, А.Ершов.

-   Приказ МЗ СССР №475 от 16.08.1989 О мерах по дальнейшему совершенствовании профилактики заболеваний ОКИ в стране (вместо пр №840 от 1976 г.)

-   Приказ МЗ СССР №445 от 20.09.1958 О дополнительных мероприятиях по снижению ОКЗ у детей раннего возраста

-   МР Выявление гемолитических, адгезивных, энтеротоксигенных энтеробактерий М.1987 МР №28-6/7

-   Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli О157:Н7 (МУ М.2001 г. МЗ РФ)

Уропатогенные эшерихии – это не те, которые являются патогенными при  ОКИ

С 1983-1985 гг. в мире перестали говорить о К-антигене у эшерихий. Обязательно определяем О-антиген, затем Н-антиген (эту работу начал ещё Кауфманн)

Сильно подкисляют среду и переходят в R-формы и погибают (собственные могильщики).

Для всех энтеробактерий рНoptim=7

тест	показатель	примечание
MR	+
VP	–
H2S↑	–	есть публикации об обнаружении E.coli, образующих сероводород. В мире до 1% образующих сероводород E.coli (на самом деле может быть 10-15% - это связано с тем, что люди, находящиеся в тесном контакте в течение 1 месяца делятся своей УПМФ – по Брейлер)
Цитрат Симмонса	–	E.blattae в 50% + у остальных 1% +
Мочевину	–	1% +
Фенилаланин	–
Подвижность	+	кроме E.blattae и неактивной E.coli
Желатин	–
Инозит	–	1% +
Арабиноза	+
Рамноза	+
Мальтоза	+
Ксилоза	+
Манноза	+
индол		E.blattae, E. vulneris
Лизин		E. hermannii, E. vulneris
Орнитин		неактивная E.coli, E. vulneris
Газ на глюкозе		неактивная E.coli
ацетат		E.blattae, E.coli
Лактоза		E. fergusonii E.blattae неактивная E.coli
Целлобиоза		E.coli E.blattae неактивная E.coli E. fergusonii E. hermannii E. vulneris
Желтый пигмент		E.blattae неактивная E.coli E. hermannii E. vulneris

Антигенная структура

164 О-серогруппы (по литературе сейчас более 170)

57 Н-антигенов

Во всём мире обязательно выдаётся ответ с указанием О- и Н-антигена.

К-антиген (капсульный), не разрушается кипячением. Этого антигена у эшерихий нет. То что считалось К-антигеном у эшерихий – это цепочки поверхностного О –антигена. В мире этот термин не употребляется.

Кауфман просил присылать серовары с описанием клиники.

У нас подобную работу проводила Новгородская. Её в первую очередь беспокоили детские поносы.

Середина ХХ века – ЭПКП=EPEC по международной классификации

По типу гастроэнтерита, напоминая сальмонеллёз и имеет перекрестные серологические реакции с сальмонеллами.

Прикрепляется к эпителию кишечника как и сальмонелла.

В мире EPEC считаются возбудителями детских (малыши до 1 года) поносов.

У взрослых – другие.

В США регулярно выпускают таблицы и там EPEC наименьшее кол-во. Считают, что они распространены в основном в развивающихся странах

В ОКА-сыворотку входят в основном ЭПКП-серовары.

Новгородская назвала эту группу ЭПКП1

ЭПКП2 группу сейчас называют ЭИКП=EIEC

Прикрепляются к клеткам эпителия толстого кишечника и проникают между клетками, как Shigella. «Дизентериеподобные» - даже становятся неподвижными.

ЭТКП=ETEC холероподобные ОКИ

ЭГКП=EHEC=STEC=VTEC

В 1982 г на сцене появилась О157:Н7

Высокий процент летальности, тяжелая клиника

2 вида токсинов:

шигатоксин I – полностью идентичен токсину Шига

шигатоксин II – идентичен токсину Шига на 60%

Острая боль, водянистая дирея→кровянистая диарея с алой кровью. У некоторых рвота. У О104 подобная клиническая картина. Восходящий отдел тонкого кишечника. У некоторых – уремический гемолитических синдром и при присоединении уремического синдрома часто летальный исход. Заражение через говядину (гамбургеры). О157:Н7 часто находят в кишечнике коров.

Потом выяснили, что шигаподобный токсин встречается у очень многих E. coli.

Если картина дизентерии, но Shigella не выделяется, а E. coli идёт в большом количестве, проверьте её на сорбит (–)

орнитин(+) лизин(+)

Тогда надо быстрее определять чувствительность к антибиотикам.

О157:Н7 может идти из молока и молочных продуктов так как было в Тульской и Кемеровской областях

У О104:Н4, О104:Н10(11), О104Н- есть и шигатоксин и веротоксин

Сейчас только появилась ЭАгЭК=EAggEC=DAEC энтероаггрегативная E. coli, диффузноаггрегативная E. coli

На культуре ткани образуют диффузные скопления, прикрепляясь к клеткам ткани. Эти E. coli могут иметь цитотоксин, который вызывает диарею у детей. У взрослых – только с иммунодефицитолм.

Развивающиеся страны: Кения, Индия, Чили, Мексика, Япония.

Дети от 1 года до 5 лет. Не было случаев чтобы заболел младенец до 1 года или взрослый без иммунодефицита.

Как правило диарея с кровью, но может быть и без крови.

О клинике, эпидемиологии и патогенезе мало известно.

Лабораторная диагностика:

Обычно сыворотки применяют после биохимического установления рода и вида.

Берём 5 колоний. Сначала – поливалентная. Затем – адсорбированная, если нет адсорбированной – используют сыворотку для линейной реакции агглютинации (пробирочному ряду).

70% физраствора и 30% чистого медицинского глицерина. Этой смесью смываем культуру и прогреваем 1 час (кипячением)

Густоту взвеси делать ≥ 4 млрд

Получасовое кипячение приводит к гипердиагностике О144

На предметном стекле большую каплю сыворотки соединить с большой каплей взвеси (адсорбированная сыворотка очищается на ионообменных смолах и, проходя через сефадекс сыворотка становится концентрированной и в подсыхающей капле по краям выпадают кристаллы полисахаридов, что похоже на агглютинацию).

Через 15 минут смотрим наличие агглютинации

Раньше патогенность – это способность вызывать заболевание. Сейчас – патогенность это характеристика генотипа, т.е. она заложена в генетическом аппарате и контролируется генами.

У Shigella и Salmonella – гены в хромосомах. А у УПМФ – внехромосомные гены (плазмиды)

Микроб пока не прикрепился, размножаться не будет.

Т.Е. для патогенности должны иметься 2 фактора: Адгезивность и токсин-или-инвазивность-или-гемолизин

Гемолизин энтеробактерий придаёт им высокую стабильность в организме.

Без определения этих факторов говорить о патогенности E. coli НЕЛЬЗЯ!!!

Нет ни одного серовара, который бы в 100% имел все факторы патогенности при выделении при ОКИ.

Например О111 – 80% имели факторы, О127-50%.

Т.е. мы можем выдать только «Выделена E. coli, серовар О000:Н00»

«не выделены E. coli, входящие в поливалентную сыворотку »

Потенциально патогенными бактериями можно заниматься только по назначению клиницистов.

А патогенные среди энтеробактерий только Shigella и некоторые Salmonella. Эшерихии – УПМФ!!!.

SHIGELLA

В глицериновом консерванте Shigella сохраняется до 10 суток (через 10 суток остаётся 40%, а на среде Кэрри-Блэр уже через сутки остаётся 40%)

SALMONELLA

-   МУ 2008 Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов А,В и С. Утвеждены Онищенко.

-   МУ 2010 Лабораторная диагностика сальмонеллёзов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды. Введены взамен МУ 1990 г. Лабораторная диагностика сальмонеллёзов человека и животных, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах, кормах и объектах окружающей среды

В последней схеме Кауфмана сальмонеллы одного серовара, но различающиеся по биохимии, объединены.

S.paratyphi B и др. объединены с S.java

Группы Е1 объединена с Е2 и Е3

Газ на глюкозе	+	S.typhi, S.typhimurium – не образуют газ S. suis, S.paratyphi А, S.paratyphi B – слабо образуют газ
Подвижность	+
Манит	+	но среди S.typhi-suis встречаются и маннитнегативные
цитрат Симмонса	+	Большинство растут
уреаза	–
Фенилаланин	–
Сахароза	–	Некоторые (S.newport) сахароза+
салицин	–	S.enteritidis встречаются+
мальтоза	+	Но бывают редких групп и S.gallinarum pulorum мальтозанегативные
Лизин	+ 90%	S.paratyphi А как правило –
Орнитин	+	S. typhi –
Лактоза	–
H2S↑	+	Но обычно S.cholerae-suis, S.typhi-suis, S.abortus-equi, некоторые редких групп – S.paratyphi А слабый H2S↑ S. typhi в 50%